褶皱假丝酵母脂肪酶热稳定性改造的设计与抗氧化酶的人工模拟

论文摘要

酶以其高效、专一和环境友好等特点,越来越广泛的被应用于人类生活的各个领域。但同传统的化学催化剂相比,酶分子的稳定性作为一项重要性质,对酶催化功能的发挥有着重要的影响。可是,由于酶的稳定性往往受到诸多因素的共同影响而决定,因此对于酶稳定性的改造一直是生物学和化学领域的难点。随着分子生物学和结构生物学等学科的不断进步,对于酶稳定性的定向进化和合理设计以及人工模拟酶的设计和构建已经逐步发展为酶工程领域针对酶稳定性研究的两个重要前沿方向。本论文将从以上两方面入手分别进行褶皱假丝酵母脂肪酶的热稳定性改造和抗氧化酶的人工模拟的研究。论文第一部分选取来源于褶皱假丝酵母的脂肪酶1 （Candida Rugosa lipase 1, CRL1）作为研究对象,利用分子生物学手段对其进行了热稳定性的改造。作为目前在国际酶制剂市场中占有较大份额的商业脂肪酶CRL的主要成分之一,CRL1具有非常广泛的应用性和市场前景。但由于来源于常温微生物,其最适反应温度仅为40℃,热稳定性很差,50℃条件下的半衰期不超过一个小时,80℃条件下几乎立即失活。较差的热稳定性已经阻碍了CRL1在工业生产中的进一步应用。由于Candida rugosa遵循一套非通用的密码子系统：即将密码子CTG编码为丝氨酸,而在通用密码子系统中是编码为亮氨酸的,这其中还包括Lip1的催化中心209位的丝氨酸,所以在前期研究中,需要将基因中的19处CTG突变为TCT.随后利用毕赤酵母工程菌GS-115异源表达Lip1,纯化之后经SDS-PAGE检测得到了分子量与天然Lip1一致的纯化重组蛋白。对重组Lip1的酶学性质进行了测定,结果显示重组的Lipl的最适温度（40℃）,45℃时的活力降为最适温度时的70%,最适pH （pH7.5）和动力学参数（kcat、Km）均与天然酶一致,证实了异源重组表达Lip1的正确性。传统的热稳定性改造主要有“定点突变”和“定向进化”两种手段,“定点突变”的工作量小,但是它的难点在于突变位点的准确预测；而“定向进化”虽然无需对突变位点进行准确预测,但是它需要构建一个很大的突变库,进行多轮的筛选,工作量很大。为了解决上述问题,在这部分实验设计中,我们引入了一个晶体学中的参数B因子（B-factor）,它表示了原子电子密度的可散播性,并且可以影响晶体中蛋白质分子的结构特征。B值越大的原子就拥有越大的灵活性。针对前人的研究成果,我们提出了本实验突变位点的选择标准。首先,为了保证突变体的最适温度上升,所选的突变位点需要位于蛋白的内部,所以所选突变位点与催化中心氨基酸的距离要小于10A；其次,根据Kazlauzkas规则,改变与催化中心的距离小于5A的氨基酸,会对酶的催化行为产生明显的影响。而由于野生型酶的催化性质已经非常优秀,在改造的时候需要尽量保留野生型的催化性质,所以所选突变位点与催化中心氨基酸距离又需要大于5A：最后,由于蛋白质内部氨基酸的B因子值一般会比较小,但是根据现有文献,B因子需要≥（蛋白中最大的3个B因子的平均值）/2才具备改造的意义。本着上述原则,我们预测出GLU 126与LEU 302可能是提升CRL1稳定性的关键突变位点。下一步的工作将利用定点饱和突变的方法对这两个位点分别进行了突变,筛选得到了热稳定性上升的突变体。论文的第二部分针对生物酶分子稳定性低、来源有限等特点,着重应用化学方法以小分子有机化合物作为模拟物,人工模拟具有谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）与过氧化氢酶（CAT）等天然抗氧化酶活性的有机小分子模拟酶。本研究首先对天然GPX的稳态和预稳态的动力学行为进行了研究,得出了模拟物对过氧化氢的结合能力才是影响模拟物活力的最主要因素。并以此为基础,以对底物过氧化氢的结合能力最好的小分子模拟物为母体,用化学合成的方法获得一种新型的GPX模拟物Mn（III）2（L-Se-SO3Na）,并利用质谱、红外光谱、核磁共振及元素分析等手段证明了模拟物结构的正确性。通过测定我们发现,模拟物的GPX活力为5.6±0.3 U/μmol,已经达到经典小分子模拟物PZ51 （Ebselen）活力的5.66倍。Mn（III） 2（L-Se-SO3Na）的SOD和CAT活力分别为138.9±1.2 U/μmol、75.0±2.3 U/μmol,实现了将生物体内三种最重要的抗氧化酶活力统一于同一个小分子模拟物中。模拟物Mn（III） 2 （L-Se-SO3Na）的稳态动力学结果显示Mn（III） 2 （L-Se-SO3Na）的表观二级速率常数kcat/KmH2O2和kcat/KmGSH分别为1.14E+07M-1min-1和1.00E+06M-1min-1,明显高于一般的小分子模拟物,成功实现了模拟物对H202的结合能力大于对GSH的结合能力的设计目标。而且Mn（III） 2 （L-Se-SO3Na）的kcat/KmH2O2与kcat/KmGSH之间的比值已经非常接近天然GPX的比值,进一步证实了模拟物拥有与天然酶相类似的动力学行为。牛心线粒体构建的氧化损伤模型进一步证实了模拟物Mn（III）2（L-Se-SO3Na）具备良好的抗氧化损伤的能力。以上结果表明,我们成功建立了一种新型的谷胱甘肽过氧化物酶模拟物的设计策略,设计并合成了一种同时具备GPX、SOD和CAT三种抗氧化酶活力的新型小分子模拟物Mn（III）2（L-Se-SO3Na）。这些研究为多功能模拟酶的设计和合成奠定了理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 脂肪酶
• 1.2 褶皱假丝酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase,CRL）
• 1.2.1 CRL的来源、组成与结构
• 1.2.2 CRL的应用
• 1.2.3 CRL1的热稳定性
• 1.3 酶稳定性改造的研究现状
• 1.4 抗氧化酶
• 1.4.1 超氧化物岐化酶（SOD）
• 1.4.2 过氧化氢酶（CAT）
• 1.4.3 谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）
• 1.5 抗氧化酶人工模拟的研究进展
• 1.6 立题依据与实验设计
• 参考文献
• 第二章 褶皱假丝酵母脂肪酶1的重组表达、纯化及性质表征
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 培养基和溶液
• 2.1.3 实验方法
• 2.1.3.1 C.rugosa Lip1基因的克隆及突变
• 2.1.3.2 重组质粒的线性化
• 2.1.3.3 毕赤酵母电转化方法
• 2.1.3.4 阳性克隆的基因组提取方法
• 2.1.3.5 外源蛋白的诱导表达
• 2.1.3.6 目的蛋白的纯化
• 2.1.3.7 脂肪酶活力测定
• 2.1.3.8 重组脂肪酶酶学性质表征
• 2.1.3.9 重组脂肪酶动力学常数测定
• 2.1.3.10 重组脂肪酶的底物选择性
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 pPICZ α A-lip1表达载体的构建
• 2.2.3 CRL1的诱导表达
• 2.2.4 CRL1的纯化
• 2.2.5 重组脂肪酶的酶学性质
• 2.2.6 重组CRL1的催化动力学
• 2.2.7 重组CRL1底物谱的测定
• 2.3 小结
• 参考文献
• 第三章 褶皱假丝酵母脂肪酶1热稳定性改造的设计
• 3.1 突变位点选择标准
• 3.2 CRL1突变位点的预测
• 3.3 小结
• 参考文献
• 第四章 抗氧化酶模拟物的合成、表征与抗氧化实验
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 实验方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 动力学分析
• 2（L-Se-SO₃Na）的合成与表征'>4.2.2 模拟物Mn（Ⅲ）₂（L-Se-SO₃Na）的合成与表征
• 4.2.3 模拟物的GPX、SOD和CAT活力的测定
• 4.2.4 模拟物的动力学常数测定
• 4.2.5 线粒体膨胀损伤实验
• 4.2.6 线粒体脂质过氧化实验
• 4.3 小结
• 参考文献
• 创新点
• 研究展望
• 攻读博士期间科研成果
• 致谢