论文摘要
前言HIV-1 nef基因是影响疾病进程的重要因素之一，其多态性可能影响HIV-1的感染和AIDS的疾病进程。调节因子Nef是一个具有多种效应功能的蛋白质，对人体内病毒复制和AIDS的发病起到重要作用。国外对B亚型、CRF01AE和SIV的研究表明nef基因的缺陷或缺失与HIV感染后疾病长期不进展相关。但对印度C亚型感染者的研究却不支持此结论。由于nef存在基因多态性，是否由于不同亚型、不同人群氨基酸序列的突变位点而导致疾病进展不同呢?B’亚型在中国流行最为广泛，中国HIV-1感染人群nef基因多态性对疾病进程的是否产生影响呢?本研究拟通过对我国B’亚型HIV-1感染者病毒基因组中nef的系统进化和氨基酸序列多态性的分析，明确中国感染HIV-1 LTNPs是否存在nef基因的缺陷和变异，及其对HIV-1疾病进展有无影响；评估nef基因的重要功能区的保守程度。为深入了解我国HIV的治病机理提供科学的依据。方法收集我国HIV感染者的流行病学资料、临床资料及全血标本。HIV-1 nef基因序列测定：QIAamp Blood Mini Kit（德国）从全血标本中提取基因组DNA（含有整合的HIV-1前病毒DNA），提取的DNA以nef基因区特异性引物O1、O2为外侧引物进行第一轮PCR扩增，以I1、I2为内侧引物进行nested-PCR扩增。1％琼脂糖凝胶电泳检测目的扩增片断，与分子量Marker对比无误后，用德国Qiagen公司的Gel Extraction Kit试剂盒对PCR产物进行纯化，使用美国Applied Biosystem公司的BigDye Terminator Sequencing试剂盒和ABI 3130型DNA测序仪测序。不同疾病进展阶段的HIV-1感染者体内HIV-1核苷酸及氨基酸序列特征分析：按不同疾病进展阶段对我国HIV-1感染者进行分组。使用BIOEDIT软件包中CLASTAL W程序进行序列排列比对，并在核苷酸序列中人工引人gaps以保持翻译完整性。并在此基础上以Mega 3.1用DNADIST程序（Kimura’s two parameters method）计算我们测得的nef序列核苷酸及氨基酸离散率，使用NEIGHBOR程序生成系统进化树（neighbor-joining algorithm）。统计nef基因区核苷酸及氨基酸突变位置和种类，并检索HIV Sequence Database，与国内外HIV流行株序列进行比较。用SPSS11.5统计软件统计分析，Yates校正的χ2检验并计算P值或双尾Fisher’s精确概率检验计算两组氨基酸突变频率的差异。基因突变与疾病进程相关程度用比值比（Odds ratio，OR）计算。结果1、中国北方地区HIV-1感染者nef序列种系发生分析中国北方地区72个HIV-1感染者核苷酸序列与M群的其他亚型nef标准株做成无根树，可以看到所有序列都在同一枝下，说明72个nef序列都为B’亚型。72个核苷酸序列种系发生分析表明，所有nef序列都在系统进化树的同一枝下，并与B.CN.02.02HNsq4有最近的亲缘关系，表明它们全部为B’亚型。LTNP组与TP组患者呈混合分布，无明显集中分布的倾向性。2、中国北方地区LTNP组与TP组nef基因离散率计算LTNP组及TP组毒株nef区序列与欧美B、泰国B亚型以及中国流行参考株（B’、A／E、B’／C）序列的离散率，发现LTNP组及TP组与中国B’亚型参考毒株B.CN.02.02HNsq4的基因距离最近，分别为5.09±0.61和5.17±0.61，略低于的两组组内基因离散率（分别为5.12±0.37和5.28±0.38）。3、中国北方地区nef氨基酸序列重要功能区多态性分析通过对nef氨基酸序列分析可以看出，发生氨基酸变异、缺失和插入等变异的序列，相应功能区的功能可能受到影响。4、中国北方地区LTNP组和TP组患者nef氨基酸序列的比较（1）中国北方地区LTNP组和TP组氨基酸缺失或插入的比较：LTNP组和TP组各有1例发生8、9号位缺失；TP组有4例发生10号位缺失，而LTNP组只有1例；TP组有3例，LTNP组有1例发生11号位缺失；38-41号位只在LTNP组的1例有4个氨基酸缺失；酸性区域（EEEE）后在TP组有5例E／G插入；TP组有2例出现156号位缺失。以上氨基酸缺失或插入在两组间比较无统计学差异。（2）中国北方地区LTNP组和TP组各位点氨基酸变异的比较：S15有R、K、N取代，但以R为主，TP组（64.29％）突变频率高于LTNP组（33.33％），两组相比有统计学差异（P＜0.01），OR=3.60（C195％1.21-10.97）；豆蔻酰化信号后的长度可变区域中，有R21→K／E／H／I／Q，以K为主，TP组和LTNP组的突变频率分别为59.52％和93.33％，两组相比有统计学差异（P＜0.005），OR=0.11（C195％0.02-0.55）；蛋白酶加工位（CAWLEAQ）前的39号位发生K被E、R、N取代，但以R为主，TP组和LTNP组突变频率分别为23.81％和0，两组相比有统计学差异（P＜0.005）。其他位点的氨基酸变异经过统计分析在两组无差异。结论1、中国北方地区HIV-1 B’亚型nef基因无明显缺失或缺陷；2、中国北方地区HIV-1 B’亚型nef基因的缺失和缺陷与疾病长期不进展无相关性；3、中国北方地区HIV-1 B’亚型nef基因序列21位K、E、H、I、Q取代R可能与疾病缓慢进展有关；4、中国北方地区HIV-1 B’亚型nef基因序列15位R、K、N取代S、39位R、E、N取代K，可能与疾病进展相关；5、中国北方地区HIV-1 B’亚型nef氨基酸序列的重要功能区较为保守。
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标签：人类免疫缺陷病毒型论文; 基因多态性论文; 长期不进展论文;