鸡肝脏和骨骼肌miRNA表达和功能研究

论文摘要

肝脏代谢和骨骼肌发育是鸡十分重要的两个生物过程,microRNA（miRNA）是一类小的非编码的约22个核苷酸长度的单链RNA分子,是基因表达的重要调控因子,其对肝脏代谢和骨骼肌发育发挥了重要的作用。本研究以鸡肝脏和骨骼肌miRNA为研究对象,对其进行了一系列的表达和功能研究,主要研究结果如下：（1）运用实时荧光定量PCR检测miR-122的组织表达,发现其在肝脏中表达量最高。运用靶基因预测软件预测出364个miR-122的靶基因,挑选其中与肝脏代谢相关的预测靶基因P4HA1、PKM2、TGF-β3、FABP5和ARCN1。实时荧光定量PCR显示miR-122在肝脏生长发育过程中上调,在鸡肝细胞离体培养过程中下调,5个基因在肝脏生长发育过程中表达不受影响,P4HA1、TGF-β3和ARCN1在肝细胞离体过程中下调,而FABP5在离体和培养过程中分别下调和上调,PKM2不受影响。体外双荧光素酶报告系统和靶位点突变实验证明5个基因及预测靶位点分别是miR-122的靶基因和靶位点,通过鸡细胞系过表达miR-122证明其对TGF-β3的调控在mRNA水平,而对P4HA1、PKM2和ARCN1的调控不在mRNA水平,表明miR-122可能通过调控这几个基因在鸡肝脏代谢中发挥调控作用。（2）原代鸡肝细胞抑制niR-122后通过转录组测序发现共有123个基因差异表达,其中64个基因表达显著上调,59个基因表达显著下调。GO分析显示21个基因参与鸡肝脏代谢过程,表明miR-122可能通过影响这些基因而调控鸡肝脏代谢。通过比较测序及实时荧光定量PCR结果发现miR-122抑制后靶基因P4HA1、PKM2、TGF-β3上调,FABP5下调,而ARCN1不受影响,Western Blotting分析表明靶基因P4HA1蛋白上调,进一步说明miR-122可调控这些靶基因。（3）使用RNA干扰技术干扰原代鸡肝细胞中miR-122靶基因TGF-β3后发现TGF-β通路下游基因ACTA2表达上调,LEF1和CCNB2表达下调,表明miR-122通过调控TGF-β3可能影响这些基因进而调控肝脏代谢。（4）运用实时荧光定量PCR检测miR-126的组织表达,发现其在肝脏中表达量很少。运用靶基因预测软件预测出54个miR-126的靶基因,挑选其中与肝脏代谢相关的预测靶基因Spredl。实时荧光定量PCR显示miR-126在肝脏生长发育过程中上调,在鸡肝细胞离体培养过程中下调,Spred1表达不受影响。体外双荧光素酶报告系统和靶位点突变实验证明Spred1及预测靶位点分别是miR-126的靶基因和靶位点,通过鸡细胞系过表达miR-126证明其对Spredl的调控不是在mRNA水平,表明miR-126可能通过调控Spredl在鸡肝脏代谢中发挥调控作用。（5）使用鸡生长激素cGH处理原代鸡肝细胞,运用高通量测序技术对其miRNA进行测序,共鉴定出216个鸡miRNA,其中受cGH影响的miRNA有56个,29个表达显著上调,27个表达显著下调,这些miRNA可能参与鸡肝脏代谢过程。（6）运用实时荧光定量PCR检测miR-1a的组织表达,发现其在骨骼肌中表达量很高。运用靶基因预测软件预测出247个miR-1a的靶基因,挑选其中与肌肉发育相关的预测靶基因ACVR1和Spred1,还有一个之前预测是miR-133a的靶基因后来验证其是miR-1a的靶基因CNBP。实时荧光定量PCR显示miR-1a在腿肌生长发育过程中表达有波动,4周时表达量高于其他时期,ACVR1和Spred1表达不受影响,CNBP先下调后上调。体外双荧光素酶报告系统证明3个基因是miR-1a的靶基因,靶位点突变实验证明ACVR1和Spred1的预测靶位点是miR-122的靶位点。通过鸡细胞系过表达miR-1a证明其对Spred1的调控在mRNA水平,而对ACVR1和CNBP的调控则不是在mRNA水平,表明miR-1a可能通过调控这几个基因在鸡骨骼肌发育中发挥调控作用。（7）运用实时荧光定量PCR检测miR-133a的组织表达,发现其在骨骼肌中表达量很高。运用靶基因预测软件预测出287个miR-133a的靶基因,挑选其中与发育相关的预测靶基因BIRC5。实时荧光定量PCR显示miR-133a在腿肌生长发育过程中先下调后上调,BIRC5表达不受影响。体外双荧光素酶报告系统和靶位点突变实验证明BIRC5及预测靶位点分别是miR-133a的靶基因和靶位点,表明miR-133a可能通过调控BIRC5在鸡骨骼肌发育中发挥调控作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 肝脏和肌肉中miRNA研究进展
• 1.1.1 miRNA的生物合成、作用机制和靶基因鉴定
• 1.1.2 miR-122
• 1.1.3 miR-126
• 1.1.4 miR-1a
• 1.1.5 miR-133a
• 1.2 畜禽miRNA研究进展
• 1.2.1 牛miRNA
• 1.2.2 鸡miRNA
• 1.2.3 猪miRNA
• 1.2.4 羊miRNA
• 1.2.5 畜禽miRNA研究展望
• 1.3 miRNA相关研究技术
• 1.3.1 实时荧光定量PCR
• 1.3.2 miRNA靶基因预测
• 1.3.3 miRNA靶基因验证
• 1.3.4 高通量测序
• 1.3.5 RNA干扰
• 1.4 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验样品
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 实验试剂
• 2.1.4 实验引物及核酸
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 miRNA及基因表达分析
• 2.2.2 miRNA靶基因验证
• 2.2.3 抑制miR-122的原代鸡肝细胞基因分析
• 2.2.4 TGF-β3 RNAi
• 2.2.5 GH处理的原代鸡肝细胞miRNA测序
• 2.2.6 数据统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 鸡miR-122功能研究
• 3.1.0 miR-122组织表达特征
• 3.1.1 miR-122靶基因预测
• 3.1.2 miR-122及靶基因在不同生长发育时期鸡肝脏中表达特征
• 3.1.3 miR-122及靶基因在原代鸡肝细胞中表达特征
• 3.1.4 miR-122靶基因验证
• 3.1.5 抑制miR-122的原代鸡肝细胞基因表达研究
• 3.1.6 干扰TGF-β3的原代鸡肝细胞基因表达研究
• 3.2 鸡miR-126功能研究
• 3.2.1 miR-126组织表达特征
• 3.2.2 miR-126靶基因预测
• 3.2.3 miR-126及靶基因在不同生长发育时期鸡肝脏中表达特征
• 3.2.4 miR-126及靶基因在原代鸡肝细胞中表达特征
• 3.2.5 miR-126靶基因验证
• 3.3 GH处理的原代鸡肝细胞miRNA表达研究
• 3.3.1 GH处理原代鸡肝细胞后IGF-I表达升高
• 3.3.2 GH处理的原代鸡肝细胞miRNA测序研究
• 3.4 鸡miR-1a功能研究
• 3.4.1 miR-1a组织表达特征
• 3.4.2 miR-1a靶基因预测
• 3.4.3 miR-1a及靶基因在不同生长发育时期鸡骨骼肌中表达特征
• 3.4.4 miR-1a靶基因验证
• 3.5 鸡miR-133a功能研究
• 3.5.1 miR-133a组织表达特征
• 3.5.2 miR-133a靶基因预测
• 3.5.3 miR-133a及靶基因在不同生长发育时期鸡骨骼肌中表达特征
• 3.5.4 miR-133a靶基因验证
• 4 讨论
• 4.1 鸡miR-122功能研究
• 4.1.1 miR-122组织表达特征
• 4.1.2 miR-122靶基因预测
• 4.1.3 miR-122及靶基因在不同生长发育时期鸡肝脏中表达特征
• 4.1.4 miR-122及靶基因在原代鸡肝细胞中表达特征
• 4.1.5 miR-122靶基因验证
• 4.1.6 抑制miR-122的原代鸡肝细胞基因表达研究
• 4.1.7 干扰TGF-β3的原代鸡肝细胞基因表达研究
• 4.2 鸡miR-126功能研究
• 4.2.1 miR-126组织表达特征
• 4.2.2 miR-126靶基因预测
• 4.2.3 miR-126及靶基因在不同生长发育时期鸡肝脏中表达特征
• 4.2.4 miR-126及靶基因在原代鸡肝细胞中表达特征
• 4.2.5 miR-126靶基因验证
• 4.3 GH处理的原代鸡肝细胞miRNA表达研究
• 4.3.1 cGH处理原代鸡肝细胞的效果
• 4.3.2 GH处理的原代鸡肝细胞miRNA测序
• 4.4 鸡miR-1a功能研究
• 4.4.1 miR-1a组织表达特征
• 4.4.2 miR-1a靶基因预测
• 4.4.3 miR-1a及靶基因在不同生长发育时期鸡骨骼肌中表达特征
• 4.4.4 miR-1a靶基因验证
• 4.5 鸡miR-133a功能研究
• 4.5.1 miR-133a组织表达特征
• 4.5.2 miR-133a靶基因预测
• 4.5.3 miR-133a及靶基因在不同生长发育时期鸡骨骼肌中表达特征
• 4.5.4 miR-133a靶基因验证
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的论文