环介导等温扩增技术快速检测转基因大豆研究

论文摘要

由于转基因植物存在的安全性问题使得转基因农作物的标签问题成为公众关注的主要热点,已有30多个国家制定了相应的法律法规对转基因作物及其衍生产品进行标签。目前,许多未经标签和认证的转基因大豆已经进入中国市场,这就迫切地需要合适的检测手段以确定这些大豆中是否含有转基因成分。传统的检测转基因大豆的方法操作繁琐、检测时间较长,通常需要57d才能完成且检出限较低,不能满足现代检测的需要。所以急需建立灵敏、可靠、快速的转基因大豆检测方法。环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是日本的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术,因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点,成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物,利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒温条件（65℃左右）下进行扩增。可以在1 h之内,将靶DNA片段扩增1091010倍。因此,LAMP技术终将会在检测领域中广泛应用。本研究针对转基因大豆的特异基因CP4-EPSPS（GenBank accession number AY5966948）设计引物,用LAMP引物在线设计引物软件设计引物。并对反应温度、反应时间、镁离子浓度、Bst DNA聚合酶浓度等扩增条件进行优化,建立LAMP反应体系。LAMP反应体系如下:F3与B3（LAMP反应外引物）各5 pmol;BIP与FIP （LAMP反应内引物）40 pmol;其它反应组分终浓度分别为:1.0 mmol/L dNTP,1.0 mmol/L Betaine,4.0 mmol/L MgSO4,2.5μL Bst DNA聚合酶缓冲液（20 mM Tris-HCl （pH8.8, 25℃）,10 mM KCl,10 mM （NH4）2SO4,2 mM MgSO4, 0.1%Triton X-100）,0.4μL Bst DNA聚合酶,1.5μL目标DNA,纯水补足体积到25μL。扩增反应条件为61℃保存1 h,80℃2 min使酶灭活。LAMP反应产物在1 %的琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像系统观察结果,产生预期的梯形条带。另外,对不同样品分别进行了PCR反应和LAMP反应来验证引物的特异性,结果表明:转基因大豆为阳性结果,其它样品均为阴性结果。采用CTAB方法制备模板进行PCR和LAMP反应,其方法的检出限分别为0.2%和0.01%,LAMP方法的检出限是PCR的20倍。LAMP扩增可在60 min内完成,对转基因大豆的检测的整个检测过程（包括DNA提取60 min、LAMP反应60 min和电泳30 min）可在2.5 h内完成。如在LAMP反应结束后的产物中加入SYBR Green I荧光染剂,通过混合液的颜色可直接判断扩增发生与否,整个检测时间可在2 h内完成,初步建立了转基因大豆的LAMP检测方法。总之,LAMP检测方法的灵敏度高、特异性好、耗时短,为转基因作物快速检测构建了良好的技术平台。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 立题的背景和意义
• 1.2 国内外转基因食品检测技术研究现状
• 1.2.1 酶联免疫吸附分析检测
• 1.2.2 聚合酶链式反应定性检测
• 1.2.3 聚合酶链式反应定量检测
• 1.2.4 基因芯片检测
• 1.3 环介导等温扩增技术
• 1.3.1 环介导等温扩增方法概述
• 1.3.2 环介导等温扩增方法特点
• 1.3.3 环介导等温扩增方法的引物设计
• 1.3.4 环介导等温扩增方法的基本原理
• 1.3.5 环介导等温扩增方法产物的检测方法
• 1.3.6 环介导等温扩增方法的应用
• 1.4 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验仪器
• 2.1.3 试验试剂
• 2.2 大豆基因组的提取方法
• 2.3 PCR 引物设计
• 2.3.1 PCR 反应引物的设计
• 2.3.2 引物的处理
• 2.4 模板DNA 的浓度测定及质量检测
• 2.5 PCR 检测条件优化
• 2.5.1 不同镁离子浓度对PCR 反应扩增效果的影响
• 2.5.2 不同退火温度对PCR 反应扩增效果的影响
• 2.5.3 不同启动方式对PCR 反应扩增效率的影响
• 2.6 PCR 反应产物的鉴定
• 2.7 PCR 引物特异性试验
• 2.8 PCR 检出限试验
• 2.9 LAMP 引物设计
• 2.9.1 LAMP 反应引物的设计
• 2.9.2 引物的处理
• 2.10 LAMP 检测条件优化
• 2.10.1 不同镁离子浓度对LAMP 反应扩增效果的影响
• 2.10.2 不同Bst DNA 聚合酶添加量对LAMP 反应扩增效果的影响
• 2.10.3 不同反应温度对LAMP 反应扩增效果的影响
• 2.10.4 不同反应时间对LAMP 反应扩增效率的影响
• 2.10.5 添加甜菜碱对LAMP 反应扩增效率的影响
• 2.11 LAMP 引物特异性试验
• 2.12 LAMP 检出限试验
• 2.13 LAMP 结果检测
• 2.13.1 LAMP 结果检测
• 2.13.2 LAMP 结果酶切分析
• 2.13.3 LAMP 产物的可视结果
• 2.14 实样大豆检测方法比较
• 3 结果与分析
• 3.1 模板DNA 浓度测定结果分析
• 3.2 模板DNA 质量控制结果分析
• 3.3 PCR 反应条件的优化
• 3.3.1 不同镁离子浓度对PCR 反应扩增效果的影响
• 3.3.2 不同退火温度对PCR 反应扩增效果的影响
• 3.3.3 不同启动方式对PCR 反应扩增效率的影响
• 3.4 PCR 引物特异性试验
• 3.5 PCR 检出限试验
• 3.6 LAMP 反应条件的优化
• 3.6.1 不同镁离子浓度对LAMP 反应扩增效果的影响
• 3.6.2 不同Bst DNA 聚合酶添加量对LAMP 反应扩增效果的影响
• 3.6.3 不同反应温度对LAMP 反应扩增效果的影响
• 3.6.4 不同反应时间对LAMP 反应扩增效率的影响
• 3.6.5 添加甜菜碱对LAMP 反应扩增效率的影响
• 3.7 LAMP 引物特异性试验
• 3.8 LAMP 检出限试验
• 3.9 LAMP 产物的酶切分析
• 3.10 LAMP 产物的可视结果
• 3.11 实样大豆检测
• 4 讨论
• 4.1 大豆基因组DNA 的提取及质量检测
• 4.2 靶基因的选择
• 4.2.1 转基因大豆内源DNA 序列信息
• 4.2.2 转基因大豆外源DNA 序列信息
• 4.3 引物的设计
• 4.3.1 PCR 检测中引物的设计
• 4.3.2 LAMP 检测中引物的设计
• 4.4 关于PCR 反应条件的优化
• 4.5 LAMP 检测体系建立的影响因素
• 4.5.1 模板DNA
• 4.5.2 DNA 聚合酶
• 4.5.3 甜菜碱
• 4.6 影响GMO 最低检测限的因素
• 4.7 污染因素及防治措施
• 4.8 LAMP 技术检测方法的优点及不足
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢