牦牛外周血单个核细胞（PBMC）抑制性消减cDNA文库的构建以及重要功能分子的克隆分析

论文摘要

外周血免疫相关细胞及其分泌的功能分子,在免疫调节、抗微生物、抗肿瘤以及细胞信号传导等方面发挥重要作用。脂多糖（LPS）和刀豆素A（ConA）作为丝裂原能激活淋巴细胞和单核细胞分泌一些细胞因子,这些因子的分泌受一个复杂的信号网络调节,该网络是由许多分子组成和参与。为筛选和发现一些新的免疫相关候选分子,研究其结构和功能以及参与免疫调节的作用机制,本研究应用抑制性消减杂交技术构建了经ConA和LPS联合刺激诱导的差异表达cDNA文库,并筛选、克隆和鉴定分析了重要功能基因。本研究以牦牛外周血单个核细胞为材料,以诱导刺激细胞的RNA合成的cDNA为试验组,以未经诱导刺激的cDNA为对照组,经消减杂交和抑制性PCR扩增,将其产物与pGEM-T Easy载体连接,转化大肠杆菌JM109,构建了牦牛外周血单个核细胞消减cDNA文库。从文库中挑选阳性克隆进行PCR鉴定,其插入片段在2001000 bp之间。随机选择非重复的6个有效EST序列,以半定量PCR方法验证其消减效率,结果显示均从消减文库中扩增到目的片段,其中5个为诱导性差异表达分子,1个为诱导特异性表达分子,说明该文库有较高的质量。文库中有效EST序列的测序和生物信息学分析表明,初步获得27条差异表达基因片段,其中3个克隆为未知功能的新基因片段序列,其余的克隆涉及蛋白质合成、翻译和表达调控、信号转导和细胞间通信、细胞凋亡、细胞和机体防御、物质转运和代谢等功能分子,这些分子的克隆和发现对动物宿主分子免疫学创新性研究奠定了基础。本研究选择文库中与趋化因子受体4（CXCR4）和胸腺素α原（ProTα）高度同源的两个分子片段为研究对象。根据牛趋化因子受体4（CXCR4）和胸腺素α原（ProTα）全长基因设计引物,扩增、克隆和鉴定趋化因子受体4（CXCR4）和胸腺素α原（ProTα）这两个与免疫和信号传导相关的差异表达重要功能分子。DNA测序及其序列分析表明,克隆的CXCR4基因的开放阅读框为1062 bp,编码353氨基酸残基的前体蛋白,与登录的CXCR4基因cDNA序列同源性为99.6%;克隆的ProTα基因的开放阅读框为333 bp,编码110个氨基酸残基的前体蛋白,与登录的ProTα基因cDNA序列同源性为98.2%。证明已成功克隆到CXCR4和ProTα全长基因。这两种重要功能分子全长基因的克隆和鉴定,对进一步研究其结构和功能以及阐述其免疫和信号传导的分子机制具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 第一章 文献综述
• 1 mRNA 差异显示技术（DDRT-PCR）
• 1.1 DDRT-PCR 的原理和方法
• 1.2 DDRT-PCR 的优点
• 1.3 DDRT-PCR 的缺点
• 1.4 DDRT-PCR 的应用和前景
• 2 cDNA 代表性差异分析（cDNA-RDA）
• 2.1 cDNA-RDA 的原理和方法
• 2.2 cDNA-RDA 的优缺点
• 2.3 cDNA-RDA 的前景
• 3 基因表达系列分析（SAGE）
• 3.1 SAGE 的原理及流程
• 3.2 SAGE 技术的优缺点
• 4 抑制性消减杂交技术（SSH）
• 4.1 SSH 的原理与方法
• 4.2 SSH 的优越性和缺陷
• 4.3 SSH 技术的应用进展
• 5 cDNA 微阵列技术
• 5.1 cDNA 微阵列技术的原理与方法
• 5.2 cDNA 微阵列技术的优点与局限性
• 6 结语
• 第二章 牦牛外周血单个核细胞（PBMC）抑制消减文库的构建与鉴定
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果
• 3.1 牦牛单个核细胞中总RNA 提取、mRNA 纯化及检测
• 3.2 双链cDNA（dscDNA）合成与酶切
• 3.3 接头连接效率的检测
• 3.4 消减第二次PCR 产物
• 3.5 消减效率检测
• 3.6 消减cDNA 文库的扩增及初步鉴定
• 3.7 文库质量鉴定
• 3.8 牦牛单个核细胞消减杂交文库差异表达基因生物信息学分析
• 4 讨论
• 4.1 文库构建分析
• 4.2 差异基因分析
• 第三章 趋化因子受体4 全长基因的克隆和序列分析
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 方法
• 3 结果
• 3.1 CXCR4 基因 PCR 扩增结果
• 3.2 酶切及 PCR 鉴定
• 3.3 核苷酸序列测定及分析
• 4 讨论
• 第四章 胸腺素 α 原全长基因的克隆和序列分析
• 1 前言
• 2 试验材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 方法
• 3 结果
• 3.1 ProTα 基因 PCR 扩增结果
• 3.2 酶切及 PCR 鉴定
• 3.3 核苷酸序列测定
• 4 讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录 BLAST 结果（部分）
• 缩略词
• 作者简介