论文摘要
碱性果胶酶（E.C.4.2.2.2）,简称PGL,是指在碱性环境下具有高活性的一类果胶酶,可以通过以反式消去作用切断聚乳糖醛酸的α-1, 4-糖苷键并释放出不饱和的寡聚半乳糖醛酸。碱性果胶酶作为煮练助剂用于纺织纤维的脱胶预处理,对纤维胶质有较好的去除作用,且对天然纤维素纤维损伤较小。因此,以碱性果胶酶为关键技术的生物酶精练替代传统的化学精练工艺,不仅可解决环境和能源等问题,而且可提高棉纺织物的品质。本论文前期研究基础为:从分离筛选得到的一株碱性果胶酶高产菌株Bacillus sp. WSHB04-02,扩增出编码碱性果胶酶的基因,成功表达于Pichia pastoris GS115。在此基础上,本论文通过详尽分析菌体和甲醇浓度对重组P. pastoris GS115高效表达的影响,得出诱导阶段甲醇浓度和菌体浓度的最佳比值;通过菌体生长阶段甘油的指数流加和诱导阶段甲醇分阶段流加策略控制甲醇和菌体浓度的最佳比值,实现了PGL的高效表达。在此基础上,探讨了诱导温度对毕赤酵母表达系统中外源蛋白降解的作用。主要研究结果如下:1)为提高重组P. pastoris GS115发酵生产碱性果胶酶的产量和生产强度,在摇瓶中优化了重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的关键因素。结果表明,初始甘油浓度40 g/L、初始甲醇浓度9%,按每24 h添加1.5%,诱导表达周期72 h、250 mL三角瓶诱导培养基装液量30 mL、初始pH 6.0,最适于菌体生长与产物表达,发酵结束时菌体干重可达40 g/L,PGL酶活可达130.6 U/mL;2)当诱导初始阶段菌体浓度分别为62.5 g/L和90 g/L时,甲醇用于细胞生长,而是PGL生产能力受限;当诱导阶段初始菌体浓度为122 g/L,甲醇几乎不用于细胞生长,而是高效地用于诱导产酶。控制体系中甲醇浓度为20 g/L时,PGL酶活最高并且生产强度最大,分别为376 U/mL和4.06 U/mL/h。另外,在一定菌体浓度下,一定范围内增加甲醇和菌体浓度的比值有利于提高PGL酶活和生产强度;3)菌体生长阶段采用甘油指数流加策略,能在较短的时间内实现菌体生长最大化。指数流加甘油19 h,菌体浓度可达到140 g/L,细胞生产强度是DO-stat法的3.4倍;4)甲醇的诱导阶段采用甲醇分阶段流加策略,成功地将甲醇与菌体浓度比例控制在0.1630.171 g/g。PGL酶活最高达430 U/mL,生产强度达到4.34 U/mL/h,产量和生产强度分别是DO-stat法的2.2倍和2.4倍,实现了高产量和高生产强度生产PGL;5)通过考察诱导温度发现:当诱导温度为30 oC时,整个过程中细胞干重基本维持在122 g/L,而在低温（26 oC和22 oC）下,菌体明显呈现出生长现象,菌体浓度分别增加到147 g/L和148 g/L。并且低温对PGL表达具有极大的促进作用。诱导温度为22 oC时,PGL最高酶活达922 U/mL,分别是30 oC （322 U/mL）和26 oC （657 U/mL）的2.9倍和1.4倍;6)在甲醇的非限制状态下,温度成为影响细胞活力的关键因素。通过检测发酵液中细胞活性和总蛋白酶活,发现:低度有利于增加细胞活力和降低细胞的死亡率。在低温下诱导,发酵上清液中几乎检测不到蛋白酶;而在高诱导温度（30 oC）下,蛋白酶活性明显增大,加剧了PGL的降解;7)降低诱导温度使胞内AOX酶活性大幅度增加,从而增强了目的蛋白PGL的表达。另外,低温下胞内参与能量代谢的各腺苷酸类物质（ATP、ADP、AMP）的含量同样也显著提高,在细胞适应甲醇后的20 h40 h内,能荷迅速降低,用作碳流转变的信号或直接用作调控重组蛋白质的合成。