自身免疫调节因子对巨噬细胞TLRs表达及其活化类型的影响

论文摘要

自身免疫调节因子（Autoimmune regulator, AIRE）是一种在调控胸腺中枢耐受中发挥着重要作用的转录激活因子。人类Aire基因的突变将导致由自身免疫应答所介导的、以多器官损伤为特征的APECED。其典型临床表现为甲状旁腺功能减退,Addison’s病和慢性皮肤粘膜念珠菌感染的三联征。在胸腺中,AIRE主要表达在胸腺髓质上皮细胞（Medullary thymic epithelial cell, mTEC）,通过调控该细胞上大量组织限制性抗原（Tissue restricted antigens, TRA）的表达,进而在自身反应性T细胞的阴性选择中起重要作用。AIRE在外周淋巴器官和组织,以及CD14+DC、单核/巨噬细胞、B细胞和粒细胞中也有表达。和胸腺中相比,AIRE在外周中的作用,尤其在血源性细胞中表达的作用,现在还不是十分清楚。而且到目前为止,APECD病人对念珠菌显著易感的原因同样尚不清楚。为了阐明AIRE在外周血源性细胞中表达的作用和意义,本研究在建立稳定表达AIRE的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞模型的基础上,探讨AIRE对巨噬细胞上TLRs表达的影响以及可能的调控机制,并检测AIRE调控的TLRs在相应配体刺激后下游靶基因的变化情况；此外,初步分析了AIRE对巨噬细胞活化类型的影响。1建立AIRE稳定表达的巨噬细胞RAW264.7模型通过构建含小鼠Aire基因的真核表达质粒pEGFPC1/mAire,经转染、筛选和鉴定,得到了稳定表达GFP-AIRE融合蛋白的RAW264.7细胞（A33-3）以及稳定表达GFP蛋白的RAW264.7细胞（C1-6）,为进一步的实验奠定基础。2 AIRE对巨噬细胞上TLRs表达的影响及其调控机制为了了解AIRE是否可以调控巨噬细胞上TLRs的表达,我们通过荧光定量PCR和Western blotting检测了A33-3与C1-6细胞之间TLRs表达差异。结果显示,在A33-3细胞中AIRE可以调控TLR1、TLR3和TLR8的表达。通过染色质免疫共沉淀（CHIP）和萤光素酶报告基因活性分析,进一步发现AIRE通过与TLR1、TLR3和TLR8的启动子相互作用,进而调控它们的表达。而且,通过TLR1和TLR3配基的刺激,我们发现AIRE能够增加其相应下游靶基因产物的表达。这些数据提示,在外周抗原提呈细胞（APC）中,AIRE可能通过调控TLRs的表达,进而对病原微生物的识别和外周免疫耐受的调控起着重要作用。3 AIRE对巨噬细胞活化类型的影响为了了解AIRE是否对巨噬细胞活化类型产生影响,我们分别用LPS、IL-4以及LPS联合免疫复合物（OVA：抗OVA）刺激A33-3和C1-6细胞,然后分别检测活化后的M1, M2a和M2b型巨噬细胞特异性细胞因子的表达变化情况。结果发现,三种不同的刺激物可以使RAW264.7细胞分别向M1、M2a和M2b三种类型活化,AIRE可能对M1型的活化有促进作用,而对M2型的活化有抑制作用,尤其是M2b型,这提示AIRE可能参与调控巨噬细胞对病原微生物的免疫防御作用。本研究的意义在于,首次证实在巨噬细胞中AIRE通过与TLR1、TLR3和TLR8的启动子相互作用,能够上调这些基因的表达,提示AIRE可能在APC对病原体的识别和外周免疫耐受调节中发挥重要作用。初步证实在巨噬细胞活化过程中AIRE使其更趋向于M1型活化,有利于机体对病原体（包括真菌）的清除和提高其抗感染能力,这也为了APECED病人对真菌易感的原因提供了一个新的解释。这些研究为我们进一步了解AIRE在外周血源性细胞中表达的作用和意义提供新的实验依据。

论文目录

• 提要
• 中文摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 自身免疫调节因子（AIRE）的研究进展
• 1.1 APECED疾病与AIRE的发现
• 1.2 AIRE的结构和功能
• 1.3 AIRE在胸腺中的作用
• 1.4 AIRE在外周中表达的作用
• 1.5 AIRE分子作用机制的特点
• 2 Toll样受体的特点及研究进展
• 2.1 TLR识别的配体
• 2.2 TLRs的定位
• 2.3 TLRs的信号路径
• 2.4 TLR在天然免疫中的作用
• 2.5 TLRs对特异性免疫的影响
• 2.6 TLRs与自身免疫病的关系
• 3 巨噬细胞的活化类型及功能
• 课题设计思路
• 实验研究
• 1 材料和方法
• 1.1 实验对象
• 1.2 质粒和菌株
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要试剂的配制
• 1.5 主要实验仪器
• 1.6 实验方法
• 2 结果
• 2.1 建立稳定表达AIRE的RAW264.7细胞系
• 2.2 AIRE对巨噬细胞上TLRs的表达影响及其机制研究
• 2.2.1 AIRE对RAW264.7细胞上TLRs的表达影响
• 2.2.2 AIRE对小鼠腹腔巨噬细胞上TLR1,TLR3和TLR8的表达影响
• 2.2.3 AIRE能与TLR1,TLR3和TLR8的启动子区相互作用
• 2.2.4 Aire增强了TLR1,TLR3和TLR8的启动子转录活性
• 2.2.5 TLR1和TLR3配基刺激对AIRE稳定表达的RAW264.7细胞靶基因产物的影响
• 2.3 AIRE对巨噬细胞活化类型的影响
• 2.3.1 三种活化的巨噬细胞亚群刺激物的最佳作用浓度
• 23.2 AIRE对M1型巨噬细胞活化的影响
• 2.3.3 AIRE对M2a型巨噬细胞活化的影响
• 2.3.4 AIRE对M2b型巨噬细胞活化的影响
• 3 讨论
• 3.1 AIRE对巨噬细胞上TLRs表达的影响及其作用机制
• 3.2 AIRE对巨噬细胞活化类型的影响
• 4 结论
• 参考文献
• 论文创新点
• 展望
• 作者简介及学术成果
• 致谢