人β地中海贫血β～（41/42）突变基因的克隆和真核表达体系的构建

论文摘要

背景:β地中海贫血（简称β地贫）是一种具有高度异质性的遗传疾病。由于β珠蛋白基因突变,造成α珠蛋白肽链和β珠蛋白肽链间的合成失平衡是其主要发病机制。在东南亚,包括我国西南、华南地区,β地贫已成为严重的公共卫生问题,其中β41/42突变是最常见的导致重型β地贫的突变之一。 目的:克隆人地中海贫血基因β41/42及调控系列LCR,构建该致病基因的体外真核表达体系,为该病基因治疗的研究提供理想模型。 方法:抽提β41/42纯合子患者的DNA,PCR扩增出人β珠蛋白基因座控制区（LCR）和β41/42基因,将其串连克隆至真核稳定表达质粒pcDNA3.1（-）中,脂质体转染至小鼠红白血病细胞（MEL）,DMSO诱导MEL细胞表达,逆转录PCR检测人β41/42基因在MEL中的表达。 结果:成功构建了包括长为2.1kb的人β41/42突变基因和长5.5kb的人β珠蛋白基因的远端调控序列（LCR）的真核表达质粒pcDNA3.1-LCR-β41/42,并使其导入MEL细胞,RT-PCR显示β41/42突变基因在MEL细胞中稳定的表达。 结论:成功构建了人β41/42突变基因的LCR/MEL体外细胞模型,该模型真实地模拟了人体内β珠蛋白基因自身的调控形式,为β41/42地贫的基因治疗研究提供了理想模型。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 一 前言
• 1：地中海贫血
• 2：β珠蛋白的基因结构
• 3：MEL细胞
• 4：β地中海贫血的治疗现状
• 5：β地中海贫血基因治疗
• 5.1 β珠蛋白基因表达调控机制
• 5.2 β地中海贫血基因治疗的策略
• 二 实验材料与仪器
• 1：菌株、质粒和细胞
• 2：主要试剂及培养基的配制
• 3：仪器与设备
• 三 技术路线
• 四 实验方法
• 41／42突变基因结构图'>1：LCR及β^41／42突变基因结构图
• 41／42重组质粒的构建图'>2：pcDNA3.1-LCR-β^41／42重组质粒的构建图
• 3：LCR的克隆
• 41／42突变全血基因组DNA制备'>3.1 人β地中海贫血β^41／42突变全血基因组DNA制备
• 3.2 引物设计
• 3.3 PCR扩增
• 3.4 LCR目的片段与pcDNA3.1（-）质粒载体的双酶切
• 3.5 LCR目的片段与pcDNA3.1（-）质粒载体的连接
• 3.6 pcDNA3.1-LCR重组质粒的转化、筛选、鉴定和大量制备
• 41／42基因的克隆'>4：β^41／42基因的克隆
• 4.1 引物设计
• 4.2 PCR扩增
• 41／42基因目的片段与pcDNA3.1-LCR质粒载体的双酶切'>4.3 β^41／42基因目的片段与pcDNA3.1-LCR质粒载体的双酶切
• 41／42基因目的片段与pcDNA3.1-LCR质粒载体的连接'>4.4 β^41／42基因目的片段与pcDNA3.1-LCR质粒载体的连接
• 41／42重组质粒的转化、筛选、鉴定和大量制备'>4.5 pcDNA3.1-LCR-β^41／42重组质粒的转化、筛选、鉴定和大量制备
• 5：MEL细胞的脂质体转染
• 5.1 MEL细胞的培养和传代
• 5.2 转染用的重组质粒DNA的制备、纯化及定量
• 5.3 重组质粒转染MEL细胞（阳离子脂质体介导转染法）
• 41／42细胞株的诱导表达及检测'>6：MELβ^41／42细胞株的诱导表达及检测
• 6.1 诱导
• 6.2 检测
• 五 结果分析
• 41／42基因的克隆'>1：LCR及β^41／42基因的克隆
• 41／42突变全血基因组DNA制备'>1.1 人β地中海贫血β^41／42突变全血基因组DNA制备
• 41／42基因的扩增'>1.2 LCR及β^41／42基因的扩增
• 1.3 重组质粒的PCR和酶切鉴定
• 1.4 基因座控制区LCR的测序
• 41／42基因的测序'>1.5 β^41／42基因的测序
• 2：MEL细胞的培养
• 3：抗性克隆的获得
• 3.1 G418筛选浓度的确定
• 3.2 抗性克隆的筛选
• 41／42总RNA的提取'>4：MELβ^41／42总RNA的提取
• 41／42突变基因在MEL细胞中的表达'>5：RT-PCR检测人β地贫β^41／42突变基因在MEL细胞中的表达
• 六 讨论
• 七 结论
• 八 附录
• 附录一： LCR基因全长测序结果
• 41/43基因全长测序结果'>附录二：β^41/43基因全长测序结果
• 附录三：LCR测序图谱
• 41/43突变基因测序图谱'>附录四：β^41/43突变基因测序图谱
• 九 参考文献
• 十 英文缩略词表
• 十一 致谢