聚羟基脂肪酸酯材料的改性和生物合成

论文题目: 聚羟基脂肪酸酯材料的改性和生物合成

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物学

作者: 郑重

导师: 陈国强

关键词: 聚羟基脂肪酸酯,羟基癸酸,硫酯酶,生物相容性

文献来源: 清华大学

发表年度: 2005

论文摘要: 聚羟基脂肪酸酯(PHA)是目前最受人们关注的生物可降解材料之一,具有生物可降解性、生物相容性等优良性质,有广泛的应用前景。本文以开发新型PHA材料为中心着重开展了两方面工作,一方面对现有PHA材料PHB和PHBHHx的共混体系进行了系统研究,提出改性现有PHA材料的新思路;另一方面对新一代PHA材料的生物代谢工程进行前期探索,取得初步成果。本文主要研究结果概括如下:1.PHB和PHBHHx在共混体系中完全相容。PHB/PHBHHx共混体系表现出典型部分结晶极性生物高分子的特性,共混材料的表面化学状态、表面活性能、极性等表面物化性质均与材料的结晶性质直接相关。2.PHB/PHBHHx膜的蛋白质吸附量和细胞粘附量依赖于共混体系的表面自由能;材料表面物化性质对细胞的增殖、成熟、分化具有强烈影响。以上两点提示可以通过简单改变材料的结晶性质调制材料的生物相容性。3.应用降落PCR技术成功克隆并验证了多个拥有自主知识产权的编码PHA中长链前体合成酶(R)-3-羟基酰基载体蛋白-辅酶A转酰基酶(PhaG)的phaG基因,提示该酶介导的代谢途径广泛存在于自然界中。4.通过异源表达phaG基因首次实现了昂贵化学品3-羟基癸酸(3HD)的直接生物合成,并初步优化了生产条件,获得专利授权。5.首次将硫酯酶II的研究与PHA及其单体的生物合成研究相联系,证明了在PhaG介导的从葡萄糖、果糖等碳水化合物直接生物合成3HD的过程中,硫酯酶II起到关键的裂解3-羟基脂酰辅酶A的作用。同时在硫酯酶II缺陷型E. coli CH01菌株中共表达PhaG和PHA聚合酶实现了利用廉价碳水化合物进行中长链PHA的生物合成。6.研究发现异源表达phaG基因造成3-羟基癸酰辅酶A的异常积累会诱导硫酯酶II的表达,提示防止胞内脂酰辅酶A的异常积累、维持胞内适宜脂酰辅酶A水平可能是硫酯酶II的重要生理生化功能,为解决困扰生物学家近40年的难题提供重要的实验依据。

论文目录:

第1章引言

1.1 微生物合成的非水溶性脂肪族聚酯——聚羟基脂肪酸酯PHA

1.2 PHA 的生物合成途径及其与中心代谢途径的耦联

1.3 PHA 代谢途径中的酶和蛋白质

1.3.1 PHA 代谢相关基因的克隆方案

1.3.2 PHA 代谢相关基因的组织形式

1.3.3 PHA 合成的关键酶——PHA 聚合酶

1.3.3.1 PHA 聚合酶的分类

1.3.3.2 对 PHA 聚合酶催化机制的推测

1.3.3.3 决定PHA 分子量和组成的因素

1.3.4 PHA 生物合成途径中提供前体的酶

1.3.4.1 β-酮基硫解酶

1.3.4.2 乙酰乙酰辅酶A 还原酶

1.3.4.3 (R)-烯酰辅酶A 水合酶

1.3.4.4 (R)-3-羟基酰基载体蛋白-辅酶A 转酰基酶

1.3.5 PHA 的工业化生产和基因工程

1.4 PHA 的物化性质

1.5 PHA 的应用

1.5.1 天然 PHA 的生物学功能

1.5.2 PHA 作为生物可降解材料的应用

1.5.3 PHA 在医用材料方面的应用

1.5.3.1 组织工程学的研究内容和现状

1.5.3.2 PHA 作为组织工程材料的应用

1.6 PHA 单体的研究情况

1.6.1 PHA 单体的研究历史

1.6.2 化学降解法获得PHA 单体

1.6.3 生物降解法获得PHA 单体

1.6.4 PHA 单体的合成

1.6.5 PHA 单体的应用

1.6.5.1 昂贵化合物合成的手性起始原料

1.6.5.2 二噁烷

1.6.5.3 内酯、环状寡聚物和接枝聚合物

1.7 PHA 研究的展望

1.8 论文的目的及意义

第2章实验材料与方法

2.1 PHB/PHBHHx共混体系表面物化性质分析方法

2.1.1 PHB/PHBHHx 共混体系膜的制备

2.1.2 差示扫描量热法分析PHB/PHBHHx共混体系膜的热性质

2.1.3 广角 X-射线衍射法分析PHB/PHBHHx共混体系膜的结晶度

2.1.4 X-射线光电子能谱分析PHB/PHBHHx共混体系膜的表面化学状态

2.1.5 PHB/PHBHHx共混体系膜接触角测量和表面自由能的计算

2.2 PHB/PHBHHx共混体系膜生物相容性分析

2.2.1 药品及试剂

2.2.2 常用溶液

2.2.3 兔关节软骨细胞的分离和培养

2.2.4 血清总蛋白吸附量的测量

2.2.5 细胞粘附量的测量

2.2.6 细胞形态和胞外基质分析

2.2.6.1 苏木精-曙红染色

2.2.6.2 DAPI 染色

2.2.6.3 胞外基质中胶原蛋白的免疫荧光检测

2.2.6.4 胞外基质中糖胺聚糖的 Alcian Blue 染色

2.3 PHA 合成代谢途径的分子生物学研究方法

2.3.1 常用实验材料

2.3.1.1 常用酶

2.3.1.2 常用缓冲液

2.3.1.3 常用试剂盒

2.3.1.4 常用 DNA 分子量标准

2.3.2 常用实验方法

2.3.2.1 常用培养基

2.3.2.2 常规分子生物学操作

2.3.2.3 大肠埃希氏菌的电穿孔转化法

2.3.2.4 大肠埃希氏菌的化学转化法

2.3.2.5 大肠埃希氏菌S17-1 介导的结合转化法

2.3.2.6 大肠埃希氏菌RNA 的提取

2.3.2.7 Wautersia eutropha 的电穿孔转化法

2.3.2.8 假单胞菌的电穿孔转化法

2.3.2.9 气相色谱和气相色谱-质谱联用检测

2.4 统计学分析

2.5 本文使用的菌种和质粒

第3章 PHBHHx 对PHB 表面物化性质的影响

3.1 PHB/PHBHHx 共混体系的热分析

3.2 PHB/PHBHHx 共混体系的结晶度分析

3.3 PHB/PHBHHx 共混体系膜的表面化学状态分析

3.4 PHB/PHBHHx 共混体系膜的表面自由能分析

3.5 讨论

3.6 小结

第4章 PHBHHx 对 PHB 生物相容性的影响

4.1 PHB/PHBHHx 共混体系膜的蛋白质吸附能力

4.2 PHB/PHBHHx 共混体系膜上软骨细胞的粘附与增殖

4.3 PHB/PHBHHx 共混体系膜上软骨细胞的形态与功能

4.4 讨论

4.5 小结

第5章 (R)-3-羟基酰基载体蛋白-辅酶A 转酰基酶基因的克隆

5.1 实验菌株的选择

5.2 (R)-3-羟基酰基载体蛋白-辅酶 A 转酰基酶基因的克隆

5.3 克隆所得DNA 片段的同源性分析

5.4 新克隆 DNA 片段的功能验证

5.4.1 表达载体pLZZH13 的构建

5.4.2 表达载体pLZZH13 表达功能的验证

5.4.3 新克隆 DNA 片段的功能验证

5.5 讨论

5.6 小结

第6章利用PhaG 实现从碳水化合物直接合成3-羟基癸酸

6.1 含有phaG 基因表达质粒pLZZGPp 的构建

6.2 在 E. coli HB101 中异源表达 P. putida phaG 基因生产3-羟基癸酸

6.2.1 E. coli HB101 (pLZZGPp)以不同碳水化合物作为碳源的生长情况

6.2.2 E. coli HB101 (pLZZGPp)利用不同碳水化合物生产3-羟基癸酸

6.2.3 E. coli HB101 (pLZZGPp)生长曲线的测量

6.2.4 各种培养基条件对3-羟基癸酸合成的综合影响

6.3 讨论

6.4 小结

第7章硫酯酶II 在PhaG 介导的细菌利用碳水化合物合成PHA/3HA过程中的作用

7.1 硫酯酶 II 在 PhaG 介导的重组 E. coli 生物合成3HD 过程中的作用

7.1.1 硫酯酶II 基因缺陷型菌株E. coli CH01 的获得

7.1.2 硫酯酶II 对PhaG 介导E. coli 合成3HD 的影响

7.1.3 异源表达phaG 基因对重组E. coli 硫酯酶II 活性的影响

7.1.4 异源表达phaG 基因对重组E. coli tesB 基因转录的影响

7.1.5 讨论

7.2 在P. putida GPp104 中异源表达tesB 基因造成的影响

7.2.1 异源表达tesB 基因诱导重组P. putida GPp104 合成3-羟基癸酸

7.2.2 异源表达tesB 基因对P. putida phaG 基因转录的影响

7.2.3 培养基中碳氮比对重组P. putida GPp104 (pLZZH09)生产3-羟基癸酸的影响

7.2.4 讨论

7.3 在硫酯酶II 缺陷型菌株E. coli CH01 中生物合成中长链PHA

7.4 小结

第8章结论

8.1 研究总结

8.2 需要进一步开展的工作

参考文献

致谢与声明

附录 A 论文部分缩略词表

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

发布时间: 2006-06-29

聚羟基脂肪酸酯材料的改性和生物合成

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