山药多糖及其硫酸化衍生物的抗病毒和增强免疫活性的比较

论文摘要

一些研究证实,天然多糖经过硫酸化修饰,不仅能提高修饰前原有的生物活性,还有可能获取新的生物活性。为了提高中药多糖的生物活性,获取更多的硫酸化多糖,可通过硫酸化修饰对其进行结构改造。山药多糖（Common Yam Rhizome polysaccharide, CYRP）是山药中重要的生物活性物质,具有增强免疫、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、降低血糖等多方面的生物活性。为了追踪山药多糖抗病毒和增强免疫活性的最佳部位并确定硫酸化修饰有无提高其抗病毒和增强免疫活性的可能性,本研究首先用分步醇沉和一步醇沉法提取分级山药多糖和山药总多糖,测定它们的体外抗病毒和增强免疫的活性,筛选出效果较好的活性部位,进一步进行硫酸化修饰,比较了其修饰前后抗病毒活性和增强免疫活性的变化。试验分为以下六个部分：试验1山药多糖的提取分别用水煎一步醇沉和水煎分步醇沉的方法从山药饮片中提取山药总多糖CYRPt和5种山药分级多糖CYRP40, CYRP50, CYRPm, CYRP70和CYRP80,用苯酚-硫酸法测定多糖含量。结果表明,各多糖的提取率以CYRPt最高,达0.8%；各分级多糖的提取率以CYRP40最高,达0.13%；各多糖的糖含量以CYRP40最高,达72.7%。试验2山药多糖抗病毒活性部位的体外筛选为了筛选出山药多糖抗病毒活性最强的部位,首先用MTT法测定山药总多糖（CYRPt）和五种分级多糖（CYRP40, CYRP550, CYRP560,CYRP70和CYRP80）对鸡胚成纤维细胞（CEF）的安全浓度,然后将安全浓度范围内的6种多糖与新城疫病毒（NDV）以三种方式（先加多糖后加病毒、先加病毒后加多糖、多糖和病毒同时加）加入到CEF的培养体系中,测定NDV感染细胞能力的变化。结果表明,先加病毒后加多糖时,CYRP40, CYRP80和CYRPt显著抑制NDV感染CEF（P<0.05）；先加多糖后加病毒时,CYRP70、CYRP80和CYRPt显著抑制NDV感染CEF （P＜0.05）, CYRPt的病毒抑制率最高,达79.62%；多糖和病毒同时加时,CYRP60, CYRP70, CYRP80和CYRPt均能显著抑制NDV感染CEF（P<0.05）, CYRPt组的病毒抑制率最高,达181.6%。因此CYRPt可能是山药多糖抗病毒活性最强的部位。试验3山药多糖增强免疫活性部位的体外筛选取安全浓度范围内5种浓度的山药总多糖CYRPt和5种分级多糖CYRP40, CYRP50, CYRP60, CYRP70, CYRP80单独或与PHA同时加入到鸡外周血淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果表明,单独作用时,CYRP40, CYRP50, CYRP80和CYRPt显著促进淋巴细胞增殖；与PHA同时加入时,六种山药多糖均能协同PHA促进淋巴细胞增殖。无论是单独还是与PHA同时加入,CYRPt组的淋巴细胞增殖率均为最高,说明CYRPti的效果最好,可能是山药多糖增强免疫活性最佳的部位。试验4山药多糖的硫酸化修饰用氯磺酸-吡啶法对纯化的山药多糖进行硫酸化修饰。以产物量和硫酸基取代度为指标,以反应温度、时间和试剂配比作为实验因素设计L9（34）正交试验,用氯化钡-明胶法测定硫酸基的取代度（DS）。结果显示,在80℃、试剂配比1：4、反应时间3h的条件下,硫酸化多糖的产物量最高,达753.5mg,各因素对产物量的影响排序为：氯磺酸与吡啶的配比>反应时间>温度；在70℃、试剂配比1：6、反应时间3h的条件下产物的硫酸基取代度最高,达1.237,各因素对取代度的影响排序为：氯磺酸与吡啶的配比>反应时间>温度。表明：对产物量和取代度影响最大的因素均为试剂配比,影响最小的为反应温度。试验5硫酸化山药多糖抗病毒活性的体外比较用MTT法测定九种硫酸化山药多糖（由实验4硫酸化修饰所得）对CEF的安全浓度,然后取安全浓度范围内5种浓度的九种硫酸化山药多糖和CYRPt与NDV以三种方式（先加多糖后加病毒、先加病毒后加多糖、多糖和病毒同时加）加入到CEF的培养体系中,测定NDV感染细胞能力的变化。结果显示,先加多糖时,sCYRP1, sCYRP2, sCYRP3, sCYRP4, sCYRP5, sCYRP6, sCYRP7和CYRPt均能显著抑制NDV感染CEF, sCYRP3在3.906μg.mL-1的病毒抑制率最高；后加多糖时,十种山药多糖均能显著抑制NDV感染CEF, sCYRP8在0.488μg.mL-1的病毒抑制率最高；多糖和病毒同时加时,sCYRP1, sCYRP2, sCYRP3, sCYRP5, sCYRP6, sCYRP7, sCYRP8, sCYRP9和CYRPt均能显著抑制NDV感染CEF, sCYRP5在1.953μg.mL-1的病毒抑制率最高。综合比较,sCYRP1的抗病毒活性最高,修饰条件为氯磺酸-吡啶比例1：4、反应温度60℃、反应时间1h；证明硫酸化修饰能够提高山药多糖的抗病毒活性。试验6硫酸化山药多糖增强免疫活性的体外比较取安全浓度范围内5种浓度的9种硫酸化山药多糖（sCYRP）和未修饰的山药多糖（CYRP1）单独或与PHA同时加入到鸡外周血淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果显示,单独作用时,sCYRP1, sCYRP3, sCYRP4, sCYRP5, sCYRP6, sCYRP8和CYRP1组的A570值显著大于细胞对照组；与PHA同时加入时,sCYRP1, sCYRP3, sCYRP4,sCYRP5, sCYRP6, sCYRP7和sCYRP9组的A570值大于PHA对照组,CYRPt组的A570值显著大于PHA对照组。在单独和与PHA同时作用时,sCYRP6的淋巴细胞增殖率都为最大值,说明sCYRP6勺增强免疫效果最好,修饰条件为氯磺酸-吡啶比例1：8、反应温度70℃、反应时间1h；硫酸化修饰能够提高CYRP的增强免疫活性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号及缩略语
• 第一章 文献综述
• 1 多糖的生物活性研究进展
• 1.1 免疫调节作用
• 1.2 抗肿瘤作用
• 1.3 抗病毒作用
• 1.4 抗衰老作用
• 1.5 降血糖作用
• 1.6 降血脂作用
• 1.7 抗凝血作用
• 2 多糖的硫酸化修饰研究进展
• 2.1 多糖的硫酸化修饰方法
• 2.2 多糖硫酸酯的生物活性
• 3 山药多糖的研究进展
• 3.1 山药多糖的提取与纯化
• 3.2 山药多糖的生物活性
• 4 本研究的目的意义
• 参考文献
• 第二章 山药多糖的提取
• 1 材料与方法
• 1.1 试验药物
• 1.2 主要试剂及配制
• 1.3 主要仪器
• 1.4 山药多糖（CYRP）的提取
• 1.5 多糖含量测定
• 1.6 蛋白含量测定
• 2 结果
• 2.1 各山药多糖的提取率、多糖含量及蛋白含量
• 3 讨论
• 3.1 山药多糖的提取方法
• 3.2 多糖含量的测定方法
• 3.3 蛋白含量的测定方法
• 参考文献
• 第三章 山药多糖抗病毒活性部位的体外筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 多糖准备
• 1.2 病毒准备
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 1.5 CYRP对CEF安全浓度的测定
• 1.6 CYRP抗新城疫病毒（NDV）感染的测定
• 1.7 数据分析
• 2 结果
• 2.1 山药多糖对CEF的最大安全浓度
• 2.2 先加多糖时NDV感染细胞能力的变化
• 2.3 后加多糖时NDV感染细胞能力的变化
• 2.4 多糖和病毒感作后加时NDV感染细胞能力的变化
• 3 讨论
• 3.1 先加多糖对NDV感染细胞能力的影响
• 3.2 后加多糖对NDV感染细胞能力的影响
• 3.3 多糖和病毒感作后加对NDV感染细胞能力的影响
• 3.4 山药多糖抗病毒作用的综合比较
• 3.5 山药多糖对CEF生长的影响
• 参考文献
• 第四章 山药多糖增强免疫活性部位的体外筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 多糖准备
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 试验方法
• 1.5 数据分析
• 2 结果
• 2.1 CYRP单独作用时淋巴细胞增殖的变化
• 2.2 CYRP与PHA共同作用时淋巴细胞增殖的变化
• 3 讨论
• 3.1 山药多糖对淋巴细胞增殖的影响
• 3.2 淋巴细胞增殖的测定方法
• 参考文献
• 第五章 山药多糖的硫酸化修饰
• 1 材料与方法
• 1.1 山药多糖的纯化
• 1.2 试剂与仪器
• 1.3 因素水平确立
• 1.4 酯化试剂制备和酯化操作
• 1.5 硫酸基取代度的测定
• 1.6 各因素与产物量和取代度的关系
• 2 结果
• t的纯化'>2.1 CYRP_t的纯化
• 2.2 正交试验结果
• 2.3 各因素与产物量的关系
• 2.4 各因素与取代度的关系
• 3 讨论
• 3.1 各因素与产物量的关系
• 3.2 各因素与取代度的关系
• 3.3 山药多糖的纯化
• 3.4 山药多糖硫酸化修饰
• 参考文献
• 第六章 硫酸化山药多糖抗病毒活性的体外比较
• 1 材料与方法
• 1.1 多糖准备
• 1.2 病毒准备
• 1.3 试剂与仪器
• 1.4 sCYRP对CEF的安全浓度测定
• 1.5 sCYRP抗NDV感染CEF能力的测定
• 1.6 数据分析
• 2 结果
• 2.1 sCYRP对CEF的影响及最大安全浓度
• 2.2 先加多糖时NDV感染CEF能力的变化
• 2.3 后加多糖时NDV感染CEF能力的变化
• 2.4 多糖和病毒感作后加时NDV感染CEF能力的变化
• 3 讨论
• 3.1 先加多糖时对NDV感染细胞能力的影响
• 3.2 后加多糖时对NDV感染细胞能力的影响
• 3.3 多糖和病毒感作后加对NDV感染细胞能力的影响
• 3.4 各山药多糖抗病毒作用的综合比较
• 3.5 取代度对sCYRP抗病毒作用的影响
• 参考文献
• 第七章 硫酸化山药多糖增强免疫活性的体外比较
• 1 材料与方法
• 1.1 多糖准备
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 试验方法
• 1.5 数据分析
• 2 结果
• 2.1 山药多糖单独作用时淋巴细胞增殖的变化
• 2.2 山药多糖与PHA共同作用时淋巴细胞增殖的变化
• 3 讨论
• 3.1 单独作用时山药多糖对淋巴细胞增殖的影响
• 3.2 与PHA共同作用时山药多糖对淋巴细胞增殖的影响
• 3.3 山药多糖与淋巴细胞增殖的量效关系
• 参考文献
• 全文总结
• 论文创新点
• 致谢