‘暗柳’甜橙红色突变体性状形成的分子机理研究

论文摘要

芽变在柑橘中经常发生。长期以来,芽变选种是柑橘育种的主要方法,但是人们对于芽变性状形成的分子机理仍知之甚少。利用现代分子生物学技术对芽变性状形成的机理进行研究,将加深对芽变规律的认识:同时对提高芽变育种效率以及提高果实品质具有重要的指导作用。本研究以‘暗柳’甜橙（Citrus sinensis[L.]Osbeck）的红肉突变体‘红暗柳’为研究材料,以野生型作参照,分析了两者果实在发育过程中糖、酸、色素的变化规律和相关基因的表达,并采用SSH结合Microarray技术分析了两者基因组表达的差异。主要研究结果如下:1.完善了不同发育时期各类柑橘组织的RNA提取方法。该方法已成功从不同发育时期的柑橘有色层、白皮层、囊衣、汁胞、愈伤组织、茎、叶、花等组织中提取出高质量的RNA。而且,将整个RNA提取时间缩短为4个小时。2.利用HPLC测定了不同发育时期‘红暗柳’与‘暗柳’果实有色层、白皮层、囊衣、汁胞中类胡萝卜素的组成与含量变化。结果表明突变体果实中白皮层、囊衣和汁胞呈红色是番茄红素大量累积所致,其番茄红素的含量比野生型相应组织高上千倍。但两者叶片中类胡萝卜素的种类没有差异。3.利用Real-time PCR测定‘红暗柳’与‘暗柳’果实有色层、白皮层、囊衣、汁胞中类胡萝卜素代谢途径关键酶基因的表达。结果发现‘红暗柳’汁胞中的番茄红素积累是由于类胡萝卜素代谢途径中上游基因的上调表达和下游基因的下调共同作用导致的。然而,‘红暗柳’果实囊衣和白皮层中类胡萝卜素代谢途径上的基因表达量与‘暗柳’相比几乎没有变化,仅下游的Lcye基因似乎受到累积的番茄红素的诱导而上调表达。这表明调控‘红暗柳’果实白皮层和囊衣中番茄红素积累的机制与调控汁胞中番茄红素积累的模式不相同,即在‘红暗柳’果实中至少存在两种模式调控番茄红素的积累。结合其它实验结果,本文提出如下假说:番茄红素首先在汁胞中大量合成,然后被运输到囊衣和白皮层中从而导致了番茄红素也在这两个部位的积累。4.采用GC和Real-time PCR测定了‘红暗柳’与‘暗柳’果实有色层、白皮层、囊衣、汁胞中主要有机酸的含量以及代谢途径关键酶基因的表达。结果发现‘红暗柳’汁胞中的柠檬酸含量极低,仅为‘暗柳’的1/11到1/4之间。而且‘红暗柳’汁胞中柠檬酸代谢上游和下游关键酶基因的表达均要高于‘暗柳’,但下游基因升高的幅度要大于上游基因升高的幅度。通过测定两者汁胞中关键酶活性发现‘红暗柳’中柠檬酸上游和下游的酶活性均要高于‘暗柳’。似乎说明‘红暗柳’汁胞中柠檬酸大幅度减少与其下游基因的大量表达有联系。5.采用GC和Real-time PCR测定了‘红暗柳’与‘暗柳’果实色层、白皮层、囊衣、汁胞中主要可溶性糖的含量以及代谢途径关键酶基因的表达。结果发现‘红暗柳’汁胞中蔗糖的含量要显著高于‘暗柳’。合成蔗糖的蔗糖磷酸合成酶和分解蔗糖的蔗糖合成酶与转化酶在‘红暗柳’汁胞中的表达均要高于‘暗柳’。推测‘红暗柳’汁胞中积累蔗糖的原因可能是上游蔗糖磷酸合成酶的上调表达,当然也有可能是蔗糖在叶片中合成以后再运输至汁胞中。6.为了获得与突变体‘红暗柳’果实特异性状相关的基因,我们构建了‘红暗柳’与‘暗柳’果实的抑制性差减文库（SSH文库）,然后采用Micrarray技术从文库中筛选在果实发育过程中差异表达的基因。在对差异表达的基因进行测序以及序列分析后,我们总共得到267条非重复性的基因,其中有182条与已知序列具有高同源性。很少有基因在果实发育过程中持续的上调或者下调表达,仅有一个基因（半胱氨酸蛋白酶前体）在‘红暗柳’果实中下调表达。经过SOTA聚类分析表明,95.1%的差异表达基因在170DAF时差异表达,而此时正是‘红暗柳’中大量积累番茄红素的时候。与细胞代谢、初生代谢、定位以及大分子代谢等相关的基因数目最多。这些基因所属的代谢途径包括:丙酮酸代谢途径、淀粉和蔗糖代谢途径、三羧酸代谢途径、糖酵解代谢途径已及类胡萝卜素合成途径等。而且,还发现13个与信号转导以及转录调控相关的基因,这些基因在170DAF时均差异表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 前言
• 1 课题提出
• 2 前人研究进展
• 2.1 芽变研究进展
• 2.1.1 芽变基础
• 2.1.1.1 芽变的概念与特点
• 2.1.1.2 芽变的细胞学和分子生物学基础
• 2.1.1.3 芽变的遗传学基础
• 2.1.2 芽变的研究和应用价值
• 2.1.2.1 芽变在科学研究中的价值
• 2.1.2.2 芽变在果树育种中的应用
• 2.1.3 芽变机理研究策略
• 2.1.3.1 分子标记在芽变研究中的应用
• 2.1.3.2 差异显示技术
• 2.1.3.3 基因全长克隆技术
• 2.1.4 果树芽变的细胞和分子机理研究进展
• 2.1.4.1 染色体结构和数目变异
• 2.1.4.2 反转录转座子插入
• 2.1.4.3 DNA甲基化
• 2.1.4.4 基因结构和表达差异
• 2.1.5 柑橘红肉突变体的研究
• 2.2 高等植物类胡萝卜素代谢研究进展
• 2.2.1 高等植物类胡萝卜素的生物合成途径
• 2.2.2 高等植物类胡萝卜素合成途径关键酶及其基因的研究进展
• 2.2.3 高等植物类胡萝卜素生物合成与调控
• 2.2.3.1 转录调控
• 2.2.3.2 转录后调控
• 2.2.3.3 类胡萝卜素储存调控
• 2.3 柑橘果实有机酸代谢研究进展
• 2.3.1 果实中有机酸的种类和含量变化
• 2.3.2 有机酸的合成部位和贮藏场所
• 2.3.3 果实中有机酸的合成代谢途径
• 2.3.4 柠檬酸代谢分子生物学研究
• 2.4 柑橘果实可溶性糖代谢研究进展
• 2.4.1 果实中糖的种类和含量变化
• 2.4.2 糖的运输
• 2.4.2.1 韧皮部运输阶段
• 2.4.2.2 糖分的后韧皮部运输阶段
• 2.4.2.3 糖分进入果实细胞液泡
• 2.4.3 糖代谢关键酶及其基因研究进展
• 2.5 抑制差减杂交技术发展与应用
• 2.6 基因芯片结合 SSH技术在植物研究上的应用
• 2.6.1 基因芯片的原理及分类
• 2.6.2 基因芯片结合 SSH技术在植物研究上的应用
• 3 本研究的目的与内容
• 材料与方法
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 色素的HPLC测定
• 2.1.1 类胡萝卜素的提取及总量测定
• 2.1.2 类胡萝卜素皂化和 HPLC检测条件
• 2.1.3 标准曲线的绘制
• 2.1.4 类胡萝卜素定性和定量分析
• 2.2 可溶性糖和有机酸的GC测定
• 2.2.1 可溶性糖和有机酸的提取
• 2.2.2 提取物的两步衍生化
• 2.2.3 糖、酸的 GC分析条件
• 2.2.4 主要糖、酸成分的定性
• 2.2.5 标准曲线的绘制
• 2.2.6 最小检测限的测定
• 2.2.7 研究方法的重复性和回收率
• 2.3 酸代谢关键酶活性测定
• 2.3.1 酶液的制备
• 2.3.2 酶活测定方法
• 2.4 RNA提取和mRNA分离
• 2.4.1 RNA提取的试剂
• 2.4.2 RNA提取的步骤
• 2.4.3 mRNA分离
• 2.5 差减cDNA文库构建
• 2.5.1 抑制性差减杂交
• 2.5.1.1 双链cDNA合成与 RsaI酶切
• 2.5.1.2 接头连接
• 2.5.1.3 差减杂交
• 2.5.1.4 两次 PCR选择性扩增
• 2.5.2 差减效率检测
• 2.5.3 差减文库生成
• 2.6 差减文库的Microarray杂交筛选
• 2.6.1 文库的扩增与纯化
• 2.6.2 点样及后处理
• 2.6.3 样品RNA提取
• 2.6.4 对样品RNA进行荧光标记
• 2.6.4.1 双链cDNA合成
• 2.6.4.2 体外转录合成cRNA
• 2.6.4.3 随机引物反转录
• 2.6.4.4 cDNA用 KLENOW酶标记
• 2.6.5 芯片杂交与清洗
• 2.6.6 芯片扫描
• 2.6.7 芯片图像的采集与数据分析
• 2.7 Real time RT-PCR分析
• 2.8 生物信息学分析
• 结果与分析
• 1 果实 RNA提取方法的改进
• 2 ‘红暗柳’与‘暗柳’果实性状比较
• 3 ‘红暗柳’与‘暗柳’类胡萝卜素代谢分析
• 3.1 有色层中两者类胡萝卜素含量和代谢途径中基因表达的差异
• 3.2 白皮层中两者类胡萝卜素含量和代谢途径中基因表达的差异
• 3.3 囊衣中两者类胡萝卜素含量和代谢途径中基因表达的差异
• 3.4 汁胞中两者类胡萝卜素含量和代谢途径中基因表达的差异
• 4 ‘红暗柳’与‘暗柳’可溶性糖代谢分析
• 4.1 有色层中两者可溶性糖含量和代谢途径中基因表达的差异
• 4.2 白皮层中两者可溶性糖含量和代谢途径中基因表达的差异
• 4.3 囊衣中两者可溶性糖含量和代谢途径中基因表达的差异
• 4.4 汁胞中两者可溶性糖含量和代谢途径中基因表达的差异
• 5 ‘红暗柳’与‘暗柳’有机酸代谢分析
• 5.1 有色层中两者有机酸含量和代谢途径中基因表达的差异
• 5.2 白皮层中两者有机酸含量和代谢途径中基因表达的差异
• 5.3 囊衣中两者有机酸含量和代谢途径中基因表达的差异
• 5.4 汁胞中两者有机酸含量和代谢途径中基因表达的差异
• 5.5 汁胞中两者有机酸代谢关键酶活性测定
• 6 差减文库构建
• 6.1 mRNA质量检测
• 6.2 cDNA合成与酶切
• 6.3 接头连接及连接效率检测
• 6.4 文库插入片段的检测
• 6.5 差减效率检测
• 6.6 差减产物克隆
• 7 基因芯片筛选
• 7.1 RNA质量检测
• 7.2 杂交筛选
• 8 生物信息学分析
• 8.1 EST分析
• 8.2 ‘红暗柳’果实性状形成过程中涉及的代谢途径
• 8.3 与‘红暗柳’果实性状形成相关的候选调控基因
• 8.4 芯片结果的Real-time验证
• 讨论
• 1 RNA提取方法的改进
• 2 ‘红暗柳’果实积累番茄红素机理探讨
• 3 ‘红暗柳’与‘暗柳’酸代谢差异机理探讨
• 4 ‘红暗柳’与‘暗柳’糖代谢差异机理探讨
• 5 与芽变性状相关的候选基因
• 5.1 有机酸代谢途径
• 5.2 脂代谢途径
• 5.3 转运
• 5.4 转录调控因子
• 6 未来研究的设想
• 参考文献
• 附录Ⅰ 柑橘不同组织 RNA高效快速提取 Protocol
• 附录Ⅱ 柑橘果实类胡萝卜素提取 Protocol
• 附录Ⅲ 柑橘果实类胡萝卜素 HPLC检测 Protocol
• 附录Ⅳ Real-time PCR测定基因相对表达 Protocol
• 附录Ⅴ Real-time PCR测定基因相对表达所用引物
• 附录Ⅵ 在‘红暗柳’与‘暗柳’果实中差异表达的克隆
• 附录Ⅶ 与‘红暗柳’果实性状形成相关的代谢途径
• 附录Ⅷ 攻读博士期间发表的论文
• 致谢