论文题目: 产蛋白酶工程菌株的构建及其释放DNA的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 遗传学
作者: 李美菊
导师: 沈萍,陈向东
关键词: 枯草芽孢杆菌,遗传工程菌株,碱性蛋白酶,释放,荧光定量,核酸分子光开关
文献来源: 武汉大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本论文对地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因进行了克隆,并转入产蛋白酶缺陷的枯草芽孢杆菌DB104菌株中,从而构建产蛋白酶的遗传工程菌株(GeneticallyEngineered Strains)。采用荧光定量PCR、核酸分子“光开关”、遗传转化等方法对该重组菌株释放DNA的情况进行了研究,并通过对两个突变株(BD1704和MD301)释放DNA情况的研究,初步探讨了枯草芽孢杆菌释放DNA的机制。获得了如下研究结果: 1.以大肠杆菌—枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBE2为载体,将包含不同调控区域的地衣芽孢杆菌L106碱性蛋白酶基因片段分别克隆到枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中。采用生物学和微量热技术对各重组菌株的研究结果证明,该基因的3′非编码区和5′上游序列均对该基因在枯草芽孢杆菌中的表达具有重要意义,只有携带该蛋白酶基因全序列的106-1片段(pAPR8*1)能在产蛋白酶缺陷的枯草芽孢杆菌DB104菌株中进行转录并获得成功表达。此外,上述基因克隆片段最初在大肠杆菌中均未得到表达,而各重组菌株间生长代谢产热曲线的微量热法分析结果显示,该基因没有得到成功表达的原因可能是其上游序列中的启动子功能不够强,通过更换含有强启动了的载体,使该基因最终在大肠杆菌中获得了表达,这说明微量热技术在某些情况下有可能为分子生物学操作提供辅助指导。
论文目录:
中文摘要
英文摘要
第一章 前言
一.有关细菌释放DNA及自然遗传转化的研究
1.细菌释放DNA的研究
2.细菌的自然遗传转化
二.环境中释放的DNA与水平基因转移
1.环境中存在的DNA
2.环境中水平基因转移的研究
三.枯草芽孢杆菌的自然遗传转化
1.枯草芽孢杆菌感受态形成的机制
2.晚期感受态蛋白的种类和功能
四.芽孢杆菌的蛋白酶研究
1.蛋白酶的应用状况
2.蛋白酶基因的克隆和表达研究
五.DNA释放及蛋白酶分泌的检测方法
1.胞外DNA的检测方法
2.蛋白酶分泌的检测方法
六.本研究的目的和意义
第二章 地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的克隆和表达及其微量热分析
1.材料与方法
1.1 菌株和质粒
1.2 培养基、试剂及主要缓冲液
1.3 实验方法
2.结果与分析
2.1 PCR引物及基因克隆策略
2.2 PCR扩增及其扩增产物的克隆
2.3 克隆片段的鉴定与检测
2.4 L106碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达
2.5 L106碱性蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达
2.6 大肠杆菌各重组菌株生长产热曲线的测定及其生长热动力学参数的计算
2.7 枯草芽孢杆菌各重组菌株生长产热曲线的测定及生长热动力学参数的计算
3.讨论
4.小结
第三章 用荧光定量PCR方法检测枯草芽孢杆菌释放的DNA
1.材料与方法
1.1 菌株和质粒
1.2 培养基、试剂及主要仪器
1.3 实验方法
2.结果与分析
2.1 引物和探针的设计
2.2 荧光定量PCR反应体系中各成分最佳浓度的测定
2.3 数据分析
2.4 滤液中目的DNA片段拷贝数的检测
2.5 重组菌株分泌的蛋白酶活性检测
2.6 滤液中具有转化活性的DNA的检测
2.7 无细胞滤液中DNase活性检测
3.讨论
4.小结
第四章 枯草芽孢杆菌胞外总DNA的测定——核酸分子“光开关”RU(PHEN)_2(DPPZ)~(2+)法
1.材料与方法
1.1 菌株和质粒
1.2 培养基、试剂及主要仪器
1.3 实验方法
2.结果与分析
2.1 Ru(phen)_2(dppz)~(2+)的光谱性质研究
2.2 缓冲溶液及pH值的选择
2.3 Ru(phen)_2(dppz)~(2+)浓度的选择
2.4 方法线性范围及检测限
2.5 细胞培养过程中(无细胞滤液的)pH的变化
2.6 无细胞滤液中蛋白质和RNA对DNA检测的影响
2.7 细菌生长过程中释放DNA的检测
3.讨论
4.小结
第五章 DNA释放与细胞生理调控系统关系的初步探索
1.材料与方法
1.1 菌株和质粒
1.2 实验方法
2.结果与分析
2.1 重组菌株K(BD1704／pAPR8-1)和L(MD301／pAPR8-1)的构建和鉴定
2.2 重组菌株K(BD1704／pAPR8-1)释放目的DNA片段的检测
2.3 重组菌株L(MD301／pAPR8-1)释放目的DNA片段的检测
3.讨论
4.小结
总结
本研究工作的主要创新点
参考文献
在读期间发表的论文
致谢
发布时间: 2006-03-27
参考文献
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