论文摘要
Toll样受体（toll-like receptor, TLRs）是近来发现的一类重要的模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）,其不同程度地表达于淋巴细胞、白细胞以及包括巨噬细胞和树突状细胞在内的单核吞噬细胞表面。TLRs能选择性地识别侵入机体的病原微生物所携带的病原相关分子模式（ pathogen associated molecular patterns,PAMPs）。CpG-ODN（CpG-oligodexynucleotides）是来自细菌、病毒等病原体基因组的非甲基化核苷酸序列。CpG-ODN和LPS等PAMPs一样,具有明确的活化天然免疫细胞的功能。人工合成的非甲基化的CpG-ODN可以在体外模拟细菌DNA作用,并主要通过TLRs9而发挥刺激细胞的作用,而且它可以作为瘤苗的佐剂。乳酸杆菌分泌物RNA作为一种PAMPs,其对免疫细胞的作用、是否也是通过TLRs或TLR9发挥刺激细胞的作用等都有待深入研究。目的:1.CpG-ODN与乳酸杆菌分泌物RNA单独或联合榄香烯复合瘤苗在体外刺激小鼠脾细胞、巨噬细胞,树突状细胞增殖的影响,及对巨噬细胞吞噬功能的影响。2.CpG-ODN与乳酸杆菌分泌物RNA单独或联合榄香烯复合瘤苗在体外冲激的小鼠树突状细胞对YAC-1的杀伤作用及INF-γ分泌的影响。3.不同处理的小鼠骨髓来源的树突状细胞刺激全脾细胞增殖及对其NF-κB的表达的影响。4.通过上述实验比较CpG-ODN与乳酸杆菌分泌物RNA对免疫细胞功能的影响观察二者在功能上是否有相似性及比较二者作为瘤苗佐剂功能的相似性。方法:1.利用小鼠脾脏来源的DC与巨噬细胞的生物学特性体外分离两者,用MTT法测其增殖活性,中性红吞噬实验测巨噬细胞的吞噬功能。2.用IL-4、GM-CSF诱导小鼠骨髓细胞体外获取BMDC,用MTT法测其增殖活性;混合淋巴反应测其刺激全脾细胞增殖的能力,Western Blot法测不同处理的BMDC NF-κB的表达。3.CpG-ODN与乳酸杆菌分泌物RNA单独或联合榄香烯复合瘤苗在体外分别刺激小鼠树突状细胞24小时,收集DC及培养上清,用MTT法测不同处理的DC对YAC-1细胞的杀伤活性,用ELISA法测DC培养上清中INF-γ的浓度。4.用倒置显微镜观察DC形态学变化。结果:1.不同处理对小鼠免疫细胞增殖的变化:①全脾细胞:CpG-ODN、CpG-ODN+瘤苗溶解物和乳酸杆菌分泌物RNA处理组对全脾细胞有促进增殖的作用,单用瘤苗与乳酸杆菌分泌物RNA+瘤苗处理组对其生长有抑制作用;CpG-ODN处理组与其它各组差异显著（P﹤0.05）。②巨噬细胞:用不同刺激物处理的脾脏巨噬细胞增殖能力与单纯对照之间差异不显著（P﹥0.05）。③脾脏来源的DC:CpG-ODN处理组和乳酸杆菌分泌物RNA处理组可促进脾脏来源DC增殖,其余各组对其生长有抑制作用;CpG-ODN处理组和乳酸杆菌分泌物RNA处理组与单纯对照和其他不同处理组的增殖指数之间差异显著（P﹤0.05）,其他组与对照之间差异不显著（P﹥0.05）。④骨髓来源的DC:用不同刺激物的处理对BMDC生长有抑制作用,各组不同处理对BMDC生长抑制作用差异不显著（P﹥0.05）。2.中性红吞噬实验检测不同处理对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响:不同的处理均可增加巨噬细胞的吞噬能力。各组不同处理的脾脏巨噬细胞吞噬中性红的能力与单纯对照之间差异显著（ P﹤0.05）,其中以CpG-ODN+瘤苗溶解物和乳酸杆菌分泌物RNA+瘤苗溶解物的OD值较其他处理组高。3.不同处理的DC对小鼠YAC-1细胞的杀伤作用:①脾脏来源的DC对小鼠YAC-1细胞的杀伤作用:按效靶比10:1,CpG-ODN+瘤苗溶解物和乳酸杆菌分泌物RNA+瘤苗溶解物对YAC-1细胞的杀伤率明显高于单纯对照组（P﹤0.05）,以CpG-ODN+瘤苗溶解物组的杀伤率最高。其他各组之间差异不显著（P﹥0.05）。②骨髓来源的DC对小鼠YAC-1细胞的杀伤作用:按效靶比10:1,经不同处理的BMDC对小鼠YAC-1细胞的YAC-1细胞杀伤有抑制作用,除CpG-ODN+瘤苗溶解物处理组外,各组对YAC-1细胞的杀伤率与单纯对照相比,明显降低（P﹤0.05）。4.不同抗原冲激的DC培养上清中INF-γ的浓度:①脾脏来源DC培养上清中γ-INF的浓度:单纯对照组为211.58±57.16 pg/ml,CpG-ODN组为456.00±31.68 pg/ml,瘤苗溶解物组为300.22±53.91 pg/ml,CpG-ODN+瘤苗溶解物组为563.44±36.77 pg/ml,乳酸杆菌分泌物RNA组为388.86±77.26 pg/ml,乳酸杆菌分泌物RNA+瘤苗溶解物组为781.00±76.42pg/ml。结果表明不同处理组与对照相比可促进DC分泌γ-INF,各处理组与对照相比差异显著（P﹤0.05）。②骨髓来源DC培养上清中γ-INF的浓度:单纯对照组为1777.77±57.16 pg/ml , CpG-ODN组为1096.00±48.41 pg/ml ,瘤苗溶解物组为1256.70±52.61 pg/ml,CpG-ODN+瘤苗溶解物组为1043.17±41.25 pg/ml,乳酸杆菌分泌物RNA组为1249.98±54.56 pg/ml,乳酸杆菌分泌物RNA+瘤苗溶解物组为1313.11±43.91pg/ml。结果显示各不同处理组与对照相比可抑制DC分泌INF-γ。5.混合淋巴反应测其刺激全脾细胞增殖的能力:用不同刺激物处理的BMDC均可刺激全脾细胞增殖,以CpG-ODN+瘤苗溶解物和乳酸杆菌分泌物RNA+瘤苗溶解物的OD值较其他处理组高。6.不同处理的BMDC NF-κB的表达的影响:不同处理组与对照相比表达明显上调。结论:本实验结果表明CpG-ODN与乳酸杆菌分泌物RNA对全脾细胞和脾脏来源的DC增殖有促进作用,对BMDC生长有抑制作用;它们不刺激巨噬细胞增殖但可以明显增强巨噬细胞的吞噬功能,并可加强瘤苗对巨噬细胞的作用。CpG-ODN与乳酸杆菌分泌物RNA冲激脾脏来源的DC可以增强其杀伤YAC-1的作用和促进脾脏来源的DC分泌INF-γ,但相同条件下对BMDC的杀伤作用是抑制的,且与单纯对照相比抑制BMDC分泌INF-γ,但其可以增加BMDC刺激全脾细胞的增殖和NF-κB的表达上调。结论:CpG-ODN与乳酸杆菌分泌物RNA在功能上有一定的相似性,并在某些方面可以加强肿瘤疫苗的作用。
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