富硒灵芝提取物工艺及抗肿瘤效果的研究

论文摘要

硒是人体必需的微量元素之一,参与人体许多组织中的重要代谢,与人类的疾病,特别是与目前严重影响人类健康的肿瘤、心血管疾病等有着密切关系。灵芝自古被誉为延年益寿之佳品,且具有良好的富集微量元素的作用。富硒灵芝产品,能够融合食用菌与硒功效于一体,有极大的实用价值。对于富硒灵芝中有效成分提取并进行抑瘤效果的研究,也可以为富硒灵芝产品的开发提供理论依据。本论文以液体发酵培养的富硒灵芝为实验原料,对其中不同溶解特性的富硒蛋白进行了体外抗氧化研究,挑选其中抗氧化活性最强的水溶性蛋白进行了提取工艺的优化,通过动物实验考察了其抑瘤效果。首先,分别用水、乙醇和碱溶液对富硒灵芝菌丝体进行提取得到水溶性、碱溶性和醇溶性三种富硒灵芝蛋白并进行检测后发现,与另外两种蛋白相比,水溶性蛋白具有最高的硒含量。同时,对三种蛋白体外抗氧化能力进行研究后发现,水溶性蛋白具有最高的还原力、最强的清除自由基和抗脂质体过氧化的能力,三种蛋白中硒含量与其抗氧化能力存在一定的量效关系。其次,对水溶性蛋白的提取工艺进行了系统的研究。首先从单因素实验出发对各实验参数进行了选择,得出提取工艺为:提取温度60℃,液料比40:1,提取时间8h,提取次数3次。接着在单因素实验基础上进行了四因素三水平的正交实验,根据正交实验的结果得出了提取的最佳条件为:9小时、pH9.0、液料比35:1、温度60℃,此种条件下水溶性蛋白提取率可达到51.56%,蛋白中硒含量为533μg/g。最后的体内实验主要是通过建立小鼠H22肝癌移植性肿瘤模型考察了水溶性硒蛋白的抗肝癌作用。通过计算抑瘤率、免疫指数及检测荷瘤小鼠肝脏匀浆中的MDA和H2O2含量及SOD、GSH-Px酶的活力等来评价富硒蛋白的药效。结果显示,水溶性富硒蛋白对小鼠肝癌H22有一定的抑制作用,其中高剂量的抑瘤率可达到41.96%;可提高小鼠体重,降低小鼠体内MDA和H2O2含量并提高小鼠体内SOD、GSH-Px酶的活力。同时从病理切片可以看出,富硒蛋白高剂量组可使肿瘤细胞出现大片的凋亡。

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摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 硒的概况

1.1.1 硒在环境中的分布

1.1.2 硒的存在形式

1.1.3 硒与人体健康的关系

1.1.4 膳食中强化硒的重要性

1.2 灵芝简介

1.2.1 灵芝中的生物活性成分

1.2.2 灵芝的药理作用

1.3 中药抗肿瘤的主要途径

1.4 富硒灵芝的研究现状

1.4.1 富硒灵芝的制备方法

1.4.2 不同硒源对富硒灵芝的影响

1.4.3 富硒灵芝的性质研究

1.4.4 富硒灵芝的功效研究

1.5 本课题的立题意义和主要内容

1.5.1 立题背景和意义

1.5.2 本课题主要研究内容

第二章不同溶解特性的富硒灵芝蛋白体外抗氧化研究

2.1 引言

2.2 实验材料与设备

2.2.1 主要实验试剂与材料

2.2.2 实验设备

2.3 实验方法

2.3.1 富硒灵芝菌丝体氨基酸分析

2.3.2 富硒灵芝不同溶解特性硒蛋白的制备

2.3.3 测定方法

2.3.4 抗氧化作用研究

2.4 结果与讨论

2.4.1 富硒灵芝菌丝体氨基酸分析结果

2.4.2 不同富硒灵芝蛋白提取物的简单比较

2.4.3 三种富硒灵芝蛋白还原力的比较

2-·]清除作用的比较'>2.4.4 三种富硒灵芝蛋白对超氧阴离子自由基[O^2-·]清除作用的比较

2.4.5 三种富硒灵芝蛋白对羟自由基清除作用的比较

2.4.6 三种富硒灵芝蛋白对DPPH 清除作用的比较

2.4.7 三种富硒灵芝蛋白抗亚油酸氧化能力的比较

2.4.8 三种富硒灵芝蛋白对卵磷脂脂质体过氧化抑制能力的比较

2.5 本章小结

第三章水溶性富硒灵芝蛋白的提取工艺研究

3.1 前言

3.2 实验材料与设备

3.2.1 主要实验试剂和材料

3.2.2 仪器设备

3.3 基本化学成分测定方法

3.3.1 蛋白质含量的测定——双缩脲法

3.3.2 硒含量的测定——3,3′-二氨基联苯胺比色法

3.3.3 水分测定：105℃恒重法（GB5512-1985）

3.3.4 等电点确定

3.4 实验方法

3.4.1 富硒灵芝粉的制备

3.4.2 水溶性硒蛋白的提取

3.4.3 水溶性硒蛋白提取率的计算

3.5 结果与讨论

3.5.1 水溶性硒蛋白等电点的确定

3.5.2 影响水溶性硒蛋白提取率的单因素分析

3.5.3 正交实验确定硒蛋白的最佳提取条件

3.5.4 富硒灵芝水溶性硒蛋白的分析

3.6 结论

第四章水溶性富硒灵芝蛋白体内抗肿瘤效果的研究

4.1 引言

4.2 材料与设备

4.2.1 动物与细胞种株

4.2.2 药品与试剂

4.2.3 仪器设备

4.3 实验方法

4.3.1 样品制备

4.3.2 动物模型的建立

4.3.3 实验方法

4.4 疗效评价

4.4.1 抑瘤率测定

4.4.2 对荷瘤小鼠免疫器官重量的影响

4.4.3 对小鼠肿瘤H22 组织及肝脏、脾和胸腺病理学的影响

2O₂ 和MDA 含量的测定'>4.4.4 小鼠肝脏中H₂O₂ 和MDA 含量的测定

4.4.5 小鼠肝脏和血清中SOD 和GSH-Px 活力的测定

4.5 统计分析

4.6 结果与讨论

4.6.1 样品对小鼠肿瘤和体重的影响

4.6.2 样品对荷瘤小鼠免疫器官脾指数、胸腺指数的影响

4.6.3 样品对肿瘤组织病理形态学的影响

4.6.4 样品对小鼠免疫器官形态学的影响

2O₂ 含量及MDA 含量的影响'>4.6.5 样品对小鼠肝脏中H₂O₂ 含量及MDA 含量的影响

4.6.6 样品对小鼠肝脏和血清中SOD 和GSH-Px 活力的影响

4.7 本章小结

全文总结与工作展望

（1）本文实验研究总结

（2）工作展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

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