茶树被茶尺蠖取食诱导的一个13-脂氧合酶基因的分离、功能鉴定与表达分析

论文摘要

茉莉酸（JA）是植物对害虫取食诱导而产生直接防御的重要信号物质，而脂氧合酶（LOX）是JA合成的关键酶之一，因此有关植物LOX研究备受关注，然而茶树体内LOX的相关研究甚少。本论文以课题组前期获得一条被茶尺蠖取食诱导表达，且可能为LOX基因的EST（GenBank：GW342753）为基础，通过cDNA全长克隆、原核表达、高效液相色谱、荧光定量PCR对茶树LOX的酶学特征和基因表达特征进行研究。主要结果如下：（1）通过cDNA末端快速克隆（RACE）方法获得一条编码茶树LOX的全长cDN A序列，其开放阅读框长度为2706bp，编码901个氨基酸，并命名为CsLOX3（GenBank：HM440161），且其理论分子量和等电点分别为101.84kD与6.39；同源比对分析结果发现CsLOX3与已经报道的茶树的CsLOX2同源性最高，为80%；生物信息学分析发现CsLOX3含有叶绿体转运肽，可能位于叶绿体，其保守功能区域有3个，且与Fe3+结合的活性位点有5个氨基酸，分别是His554，His559，His751，Asn755， Ile901。（2）原核表达分析表明，重组后CsLOX3主要分布于此基因转化的大肠杆菌裂解物上清中，SDS-PAGE显示其分子量为120kD左右。利用Co2+-TALON Resin树脂进行蛋白质纯化，并对其进行相关酶学活性分析表明，CsLOX3发挥酶活的最适温度为45°C，此温度下酶活力为(24.6mmol min-1mg-1)最适pH5.0，此pH下酶活力为(22.57mmol min-1mg-1)；通过HPLC分析发现，原核表达的CsLOX3酶促反应只生成13-HPOT，因此属于13S-LOX类型。（3）qRT-PCR分析表明，C sLOX3基因在茶树果实形成和开花初期表达量较低，而在成熟期和盛花期表达量皆上升到最大，分别为初期的16倍与15.3倍；CsLOX3基因在茶尺蠖取食后6-24h一直处于上调表达状态，但是不同品种表达规律不尽相同，上调表达的开始时间和最大表达量出现时间都是舒茶早品种较龙井43晚，但是最大表达量相差不大，分别比对照高出10倍与13.6倍；机械损伤对其表达规律影响与茶尺蠖取食相近，只是品种间差异较大，表现为舒茶早的CsLOX3基因最大表达量要明显大于龙井43，分别是各自对照的10.6倍与3.6倍；MeJA处理龙井43后2d， CsLOX3基因表达量急剧升高至对照的17.3倍，至4d后又急剧下降，而对舒茶早影响不大，最大表达量仅是对照的2.1倍。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 植物脂氧合酶的基本特征
• 1.1.1 脂氧合酶的生化特征
• 1.1.2 脂氧合酶的分布
• 1.1.3 脂氧合酶的家族分类
• 1.2 植物脂氧合酶在植物器官发育中的作用
• 1.3 植物脂氧合酶在非生物胁迫诱导中的作用
• 1.4 植物脂氧合酶在生物逆境诱导防御中的作用
• 1.4.1 脂氧合酶在病害诱导防御中的研究进展
• 1.4.2 脂氧合酶在病害诱导防御中的作用机理
• 1.4.3 脂氧合酶在虫害诱导防御中的研究进展
• 1.4.4 脂氧合酶在虫害诱导防御中的作用机理
• 2 引言
• 2.1 研究意义及目的
• 2.2 研究内容
• 2.2.1 利用 RACE 克隆 CsLOX3 的 cDNA 全长
• 2.2.2 LOXs 氨基酸序列分析及进化树构建
• 2.2.3 CsLOX3 原核表达及产物鉴定
• 2.2.4 茶树叶片 CsLOX3 表达的 qRT-PCR 分析
• 2.3 技术路线
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 茶树品种
• 3.1.2 茶尺蠖及试验处理
• 3.2 仪器与试剂
• 3.2.1 主要实验仪器
• 3.2.2 主要试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 茶树叶片总 RNA 的提取及质量检测
• 3.3.2 CsLOX3 的 cDNA 全长克隆
• 3.3.3 CsLOX3 cDNA 全长序列的生物信息学分析
• 3.3.4 CsLOX3 原核载体构建与转化
• 3.3.5 CsLOX3 原核蛋白表达
• 3.3.6 CsLOX3 原核蛋白表达条件的优化
• 3.3.7 CsLOX3 原核表达蛋白的纯化
• 3.3.8 CsLOX3 原核表达蛋白的酶活测定及产物鉴定
• 3.3.9 CsLOX3 表达的 qRT-PCR 分析
• 4 结果与分析
• 4.1 茶树叶片总 RNA 的提取与检测
• 4.1.1 总 RNA 的提取
• 4.1.2 提取 RNA 的纯度检测
• 4.1.3 cDNA 第一链的电泳检测及浓度测定
• 4.2 CSLOX3 的 CDNA全长克隆与序列分析
• 4.2.1 CsLOX3 基因的 3′/5′-RACE 克隆
• 4.2.2 CsLOX3 的全长克隆
• 4.3 CSLOXS 的序列分析
• 4.3.1 保守区域预测与分析
• 4.3.2 LOXs 进化树分析
• 4.3.3 氨基酸序列特征的比对与分析
• 4.4 CSLOX3 原核表达
• 4.4.1 CsLOX3 表达载体的构建
• 4.4.2 CsLOX3 的原核表达优化
• 4.4.3 CsLOX3 原核表达蛋白的纯化
• 4.4.4 CsLOX3 原核表达蛋白的酶活力测定
• 4.4.5 CsLOX3 原核蛋白催化反应的产物鉴定
• 4.5 茶树中 CSLOX3基因的表达特征分析
• 4.5.1 不同发育阶段的表达特征
• 4.5.2 茶尺蠖取食诱导的表达特征
• 4.5.3 机械损失诱导的表达特征
• 4.5.4 MeJA 和 SA 诱导表达特征
• 5 讨论
• 5.1 LOXS 氨基酸序列特征的比较分析
• 5.2 原核表达与酶活产物确定
• 5.3 实时荧光定量 PCR 技术
• 5.4 CSLOX3 在茶树中的功能探讨
• 6 结论
• 参考文献
• 附录 A 中英文缩写与注释
• 致谢
• 作者简介