七种卷柏属药用植物抑制黄嘌呤氧化酶、脂氧化酶和环氧化酶的活性作用研究

论文摘要

黄嘌呤氧化酶（XOD）、脂氧化酶（LOX）和环氧化酶（COX）是人体中涉及氧化过程的几种重要的氧化酶,这些酶的高度表达,与自由基产生和炎症、硬化、心血管疾病、衰老、癌症等病理过程密切相关。这几种酶的抑制剂对于清除自由基、减少炎症、促进组织修复、控制一些疾病（如癌症、病毒性疾病）的发展具有重要意义。我国卷柏属（Selaginella）植物有60-70种,湖北省的卷柏属药用植物共有14种,广泛用于治疗癌症、病毒性肝炎等多种疾病。药理研究证实,卷柏属药用植物具有广泛的药理活性,尤其在抗肿瘤、抗病毒、降血糖、抑菌与抗炎方面的功能较为显著。并且本属植物普遍含有穗花杉双黄酮等多种双黄酮类抗肿瘤活性成分,还发现具有抗病毒作用的活性成分。为此,对7种卷柏属药用植物进行了黄嘌呤氧化酶、脂氧化酶抑制剂的筛选研究和和下调环氧化酶-2mRNA作用的活性物质研究,并进一步进行了抗肿瘤、抗病毒作用的实验研究,为寻找研制新的抗肿瘤、抗病毒的辅助治疗药物,提供依据。用带有酶动力学分析软件的紫外分光光度计,检测7种卷柏属药用植物的28种提取物、3种总黄酮、8种单体化合物和12个流分在体外对黄嘌呤氧化酶活性的影响。结果显示乙酸乙酯提取物和95%乙醇提取物是抑制XOD的活性部位。3种总黄酮（翠云草总黄酮、江南卷柏总黄酮、细叶卷柏总黄酮）和3种化合物（罗波斯塔双黄酮、2,3-二氢-3’,3”’-双芹菜素和2”,3”-二氢-5,5”,7,7”,4’-五羟基-[3’-0-4”’]-双黄酮）对XOD的抑制作用较强。其中罗波斯塔双黄酮抑制XOD活性的作用最强,与阳性对照品槲皮素相近。实验还表明,垫状卷柏甲醇部位10个流分（Fr1～Fr10）中,Fr5对XOD的抑制活性最强。继续将Fr5分离纯化,则活性降低。说明垫状卷柏双黄酮成分的抗氧化活性不仅体现于单一成分,还体现在它们的整体效应。运用脂氧化酶体外抑制实验,检测7种卷柏属药用植物的28种提取物、12种单体化合物和3个组分对脂氧化酶活性的影响。结果显示乙酸乙酯提取物和95%乙醇提取物（薄叶卷柏除外）是主要活性部位。有6种单体化合物对LOX显示较强的抑制活性,强弱顺序为:圣草酚、穗花衫双黄酮、罗波斯塔双黄酮、罗波斯塔双黄酮-4’-甲醚、2”,3”-二氢-5,5”,7,7”,4’-五羟基-[3’-0-4”’]-双黄酮、2,3-二氢-3’,3”’-双芹菜素。采用RT-PCR技术,测定从细叶卷柏提取的5种化合物对HT-29细胞中COX-2mRNA表达的影响。结果表明:这5种化合物的灰度值分别与其样品终浓度呈负相关。说明穗花杉双黄酮、罗波斯塔双黄酮-4’-甲醚、2”,3”-二氢-5,5”,7,7”,4’-五羟基-6,6”-二甲基-[3’-0-4”’]-双黄酮、2”,3”-二氢-5,5”,7,7”,4”’-五羟基-6,6”-二甲基-[4’-0-3”’]-双黄酮和2”,3”-二氢-5,5”,7,7”,4’-五羟基-[3’0-4”’]-双黄酮这5种化合物,均可在mRNA水平抑制结肠癌细胞COX-2的表达。采用噻唑蓝（MTT）法,观察从细叶卷柏提取的4种化合物对体外培养结肠癌HT-29细胞增殖的影响。结果表明罗波斯塔双黄酮-4’-甲醚、穗花衫双黄酮、2”,3”-二氢-5,5”,7,7”,4’-五羟基-6,6”-二甲基-[3’-0-4”’]-双黄酮和2”,3”-二氢-5,5”,7,7”,4”’-五羟基-6,6”-二甲基-[4’-0-3”’]-双黄酮对HT-29细胞的生长增殖具有明显抑制作用,浓度在12.5μg/mL～100μg/mL时,其作用有量效关系。采用卷柏属药用植物的13种提取物培养CVB3感染的Hep-2细胞,观察比较细胞病变效应（CPE）,72h后MTT法测定细胞活性,采用治疗指数(TI=TC50/IC50)作为评价指标来衡量药物对CVB3的抑制效力。结果为薄叶卷柏、蔬叶卷柏、江南卷柏这3种卷柏的乙酸乙脂提取物和95%乙醇提取物、垫状卷柏95%乙醇提取物、细叶卷柏水提物对CVB3病毒具有杀灭或抑制作用,翠云草对病毒没有作用。本研究还表明,乙酸乙酯提取物和95%乙醇提取物是卷柏属药用药物抑制黄嘌呤氧化酶和脂氧化酶的活性部位。有1种化合物2”,3”-二氢-5,5”,7,7”,4’-五羟基-[3’-0-4”’]-双黄酮对黄嘌呤氧化酶、脂氧化酶和环氧化酶这3种酶均具有抑制作用。有2种化合物罗波斯塔双黄酮和2,3-二氢-3’,3”’-双芹菜素对黄嘌呤氧化酶和脂氧化酶均具有明显抑制作用;有4种化合物穗花衫双黄酮、罗波斯塔双黄酮-4’-甲醚、2”,3”-二氢-5,5”,7,7”,4’-五羟基-6,6”-二甲基-[3’-0-4”’]-双黄酮和2”,3”-二氢-5,5”,7,7”,4”’-五羟基-6,6”-二甲基-[4’-0-3”’]-双黄酮对环氧化酶-2具有抑制作用,并能抑制HT-29细胞的生长繁殖。黄酮类化合物是一类作用较温和的成分类型,随着它们抗氧化和清除自由基的作用被深刻认识,它们对人类健康的维护作用也逐渐被越来越重视。上述研究为从卷柏属药用植物多靶点、多途径控制炎症的发展,防止疾病的恶化,以及对科学、合理地整体利用卷柏属植物资源提供了一定的实验依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 卷柏属药用植物抑制黄嘌呤氧化酶的活性研究
• 1 提取物抑制黄嘌呤氧化酶活性的筛选研究
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 仪器和试剂
• 1.1.2 植物材料
• 1.1.3 植物提取物的制备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 底物溶液
• 1.2.2 XOD活力测定
• 1.2.3 样品测定
• 1.2.4 空白对照
• 1.2.5 XOD对照品测定
• 1.2.6 阳性对照品
• 1.3 实验结果
• 1.4 讨论
• 1.4.1 有效部位的确定
• 1.4.2 活性较高的药材
• 1.4.3 新的探索方向
• 1.4.4 室温对测定结果的影响
• 2 总黄酮及单体化合物抑制黄嘌呤氧化酶的活性研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 仪器和试剂
• 2.1.2 样品来源
• 2.1.3 试液配制
• 2.2 实验方法
• 2.3 实验结果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 对样品抑制XOD活性的初步分析
• 2.4.2 对化合物构效关系的初步分析
• 3 黄酮化合物抑制黄嘌呤氧化酶的协同作用研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 仪器和试剂
• 3.1.2 植物材料
• 3.1.3 垫状卷柏各流分的制备
• 3.1.4 样品和对照品溶液
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 溶液配制
• 3.2.2 酶活力测定
• 3.2.3 样品测定
• 3.2.4 空白对照
• 50的计算'>3.2.5 半数抑制浓度IC₅₀的计算
• 3.3 实验结果
• 3.4 讨论
• 参考文献
• 第二章 卷柏属药用植物抑制脂氧化酶的活性研究
• 1 提取物抑制脂氧化酶活性的筛选研究
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 仪器和试剂
• 1.1.2 植物材料
• 1.1.3 植物提取物的制备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 试液配制
• 1.2.2 LOX活力测定
• 1.2.3 样品测定
• 1.2.4 空白对照
• 1.2.5 LOX对照品测定
• 1.2.6 阳性对照品
• 1.3 实验结果
• 1.4 讨论
• 2 单体化合物抑制脂氧化酶的活性研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 仪器和试剂
• 2.1.2 样品来源
• 2.1.3 试液配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 LOX活力测定
• 2.2.2 样品测定
• 2.2.3 空白对照
• 2.2.4 LOX对照品测定
• 2.2.5 阳性对照品
• 2.3 实验结果
• 2.4 讨论
• 参考文献
• 第三章 卷柏属药用植物抑制环氧化酶的活性研究
• 1 实验材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 样品来源
• 1.3 主要试剂及酶类
• 1.4 主要仪器和器材
• 2 实验方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 细胞总RNA的提取
• 2.3 RT-PCR检测COX-2 mRNA的表达
• 2.4 统计处理
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 4.1 各样品对HT-29细胞COX-2的影响
• 4.2 关于总RNA的提取方法
• 参考文献
• 第四章 4种化合物对结肠癌HT-29细胞生长增殖的影响
• 1 实验材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 样品来源
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 1.5 主要试剂配制
• 2 实验方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 接种细胞
• 2.3 添加药物
• 2.4 加MTT液
• 2.5 测A值
• 2.6 结果计算
• 3 实验结果
• 3.1 罗波斯塔双黄酮-4'-甲醚
• 3.2 2",3"-二氢-5,5",7,7",3"'-五羟基-6,6"-二甲基-[4'-0-3"']-双黄酮
• 3.3 2",3"-二氢-5,5",7,7",3'-五羟基-6,6"-二甲基-[3'-0-4"']-双黄酮
• 3.4 穗花杉双黄酮
• 4 讨论
• 参考文献
• 第五章 卷柏属药用植物抗病毒作用研究
• 1 实验材料
• 1.1 植物样品
• 1.2 提取物制备
• 1.3 试验仪器
• 1.4 试验试剂
• 1.5 主要溶液配制
• 1.6 细胞株
• 1.7 病毒株
• 2 实验方法
• 2.1 药物样品对细胞的毒性测定
• 2.2 药物样品体外抗病毒试验
• 2.2.1 药物样品抗病毒吸附组
• 2.2.2 药物样品对病毒直接作用组
• 2.2.3 药物样品抗病毒生物合成组
• 2.2.4 细胞活性测定和试验数据处理
• 3 试验结果
• 3.1 药物样品对Hep-2细胞的毒性
• 3.2 药物抗病毒吸附组
• 3.3 药物直接作用组
• 3.4 药物抗病毒生物合成组
• 4 讨论
• 参考文献
• 第六章 文献综述
• 1 黄嘌呤氧化酶、脂氧化酶和环氧化酶及其抑制剂的研究进展
• 2 中草药来源的黄嘌呤氧化酶抑制剂的研究进展
• 3 中药中的天然环氧化酶和脂氧化酶抑制剂的研究进展
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 博士研究生期间已发表、待发表的论文及申报专利