敲除3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD对工业酒精酵母发酵的影响

论文摘要

目前,燃料乙醇作为新型清洁燃料,正无可争议地成为世界各国的研发重点。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）发酵产生乙醇的过程中,甘油的生成所消耗的碳源约占总碳源的4 %～10 %。减少甘油合成量可提高乙醇产率与碳源利用率。其主要策略是修饰或切除一步或多步代谢反应,或引入外源相关基因以改变碳流方向与碳流量,从而使反应向有利于生成更多乙醇而少生成甘油的方向进行。甘油是经由糖酵解途径（EMP）的中间物磷酸二轻丙酮引出的一条支路。磷酸二经丙酮经加氢还原为3-磷酸甘油后再脱去磷酸形成甘油。其中第1步反应由合成甘油的关键酶（GPD）所催化。GPD有2个同功酶,分别由基因GPD1和GPD2编码。以工业酒精酵母Saccharomyces cerevisiae Y为出发菌株,首先通过产孢率比较,选定McClary培养基为产孢培养基。通过生孢法获得6株单倍体,再与模式菌株W303-1A的杂交鉴定出此菌株的两个不同类型的单倍体α型和a型。以pUC19质粒为载体,构建含有GPD1同源基因的重组质粒pUC-GPD1::?Km,线性化后整合到S.cerevisiae-Y（a）的染色体,获得了突变GPD1基因的重组菌S.cerevisiae-Y（a,△gpd1）。将重组质粒pPIC-GPD2-bgl-hyg用限制性内切酶HindIII线性化后,电击转化进入感受态工业酿酒酵母S.cerevisiae-Y的a型单倍体和α型单倍体中,获得重组菌S.cerevisiae-Y（a,△gpd2）和S.cerevisiae-Y（α,△gpd2）。借鉴酵母双杂交技术原理,将S.cerevisiae-Y（a,△gpd1）和S.cerevisiae-Y（α）,S.cerevisiae-Y（a,△gpd2）和S.cerevisiae-Y（α,△gpd2）分别进行群体杂交,通过产孢法和PCR的方法鉴定出分别全突变掉GPD1和GPD2基因的双倍体菌株S.cerevisiae-Y（△gpd1,△gpd1）,S.cerevisiae-Y（△gpd2,△gpd2）。以葡萄糖为底物的发酵实验表明重组菌S.cerevisiae-Y（a,△gpd1）,S.cerevisiae-Y（α,△gpd2）分别与S.cerevisiae-Y（a）和S.cerevisiae-Y（α）比较甘油产量则是下降了24.83 %和22.35 %,而酒精产量则都略有所提高。而重组菌S.cerevisiae-Y（△gpd1,△gpd1）,S.cerevisiae-Y（△gpd2,△gpd2）与宿主菌S.cerevisiae-Y比较,它们的生长速率比较缓慢,葡萄糖的利用消耗速率也有所下降,同时它们的葡萄糖转甘油率分别较宿主菌下降了11.66 %和20.71 %,而葡萄糖转酒精率分别较宿主菌增加了5.90 %和13.20 %。同时考察了发酵的次要副产物丙酮酸和乙酸的产量,发现这两株重组菌的丙酮酸和乙酸量都有所减少。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 发展燃料酒精的意义和现状
• 1.2 酒精与甘油的内在联系
• 1.2.1 酒精与甘油在代谢途径中的联系
• 1.2.2 酒精与甘油在呼吸链中的联系
• 1.3 甘油合成途径中关键酶基因分析及其在发酵过程中的作用
• 1.3.1 甘油合成途径中关键酶基因分析
• 1.3.2 GPD 在酒精发酵过程中的作用
• 1.4 基困敲除技术在工程菌构建中的应用
• 1.4.1 基因敲除的操作步骤
• 1.4.2 敲除策略的选择
• 1.5 工业酵母菌和实验室酵母菌的差异
• 1.6 阻断甘油的合成提高乙醇发酵产率的尝试
• 1.6.1 阻断实验室酵母甘油合成途径的尝试
• 1.6.2 阻断工业酵母甘油合成途径的尝试
• 1.7 立题依据与意义
• 1.8 研究内容
• 第二章 工业酒精酵母单倍体的获得
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 子囊孢子染色用试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 诱导孢子形成的方法
• 2.2.2 孢子的分离和单倍体的制备
• 2.2.3 单倍体的鉴定
• 2.2.4 子囊孢子的染色观察
• 2.2.5 单倍体的杂交
• 2.2.6 菌株生长曲线的测定
• 2.2.7 菌落形态
• 2.2.8 巨大菌落形态
• 2.3 结果
• 2.3.1 高产孢率培养基的筛选
• 2.3.2 单倍体的获得
• 2.3.3 单倍体类型的区分
• 2.3.4 单倍体交配型的确定
• 2.3.5 单倍体基本性状的考察
• 2.4 本章小结
• 第三章 GPD1 和GPD2 基因的敲除
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 培养基、工具酶和试剂
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 工业酿酒酵母染色体的提取
• 3.2.2 工业酿酒酵母GPD1 基因的PCR 扩增
• 3.2.3 大肠杆菌E. coli 感受态的制备及简易转化程序
• 3.2.4 E.coli 质粒的快速提取
• 3.2.5 质粒的大量提取
• 3.2.6 PCR 产物的纯化
• 3.2.7 琼脂糖凝胶电泳
• 3.2.8 工业酿酒酵母电穿孔转化法
• 3.3 结果
• 3.3.1 含有GPD1 同源基因的质粒构建
• 3.3.2 含有GPD2 同源基因的质粒
• 3.3.3 酵母的电击转化
• 3.3.4 重组子的验证
• 3.3.5 杂交方法敲除另一等位基因
• 3.4 本章小结
• 第四章 重组酿酒酵母的发酵实验
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株与质粒
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 主要仪器设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 酒精发酵工艺
• 4.2.2 生长量测定
• 4.2.3 分析样品处理
• 4.2.4 残糖及发酵产物的分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 考察突变GPD1 基因的单倍体重组菌以葡萄糖底物中的发酵过程
• 4.3.2 考察突变GPD2 基因的单倍体重组菌以葡萄糖底物中的发酵过程
• 4.3.3 考察二倍体重组菌以葡萄糖底物中的发酵过程
• 4.4 本章小结
• 结论与展望
• 一主要结论
• 二展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文