克胰素（HWTX-Ⅺ）在巴氏毕赤酵母中的表达

论文摘要

克胰素（HWTX-Ⅺ）是从虎纹捕鸟蛛毒素中新发现的一种毒素,由55个氨基酸残基组成,其中6个半胱氨酸形成3对二硫键,相对分子质量为6166.2Da。克胰素属于BPTI/Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂家族,是一种极强的胰蛋白酶抑制剂,抑制活性强于BPTI。初步的药理学实验证实克胰素在动物急性胰腺炎模型上具有较好的疗效,表明克胰素在治疗与胰蛋白酶相关的疾病中有良好的应用前景。本室已经实现了重组克胰素在原核表达系统和酿酒酵母表达系统中的成功表达,但是这些表达系统仅限于实验室规模的表达,表达量无法应用于规模化制备,从而影响克胰素药物分子的研发。毕赤酵母（Pichia.pastoris）表达系统是一种近年来发展迅速的真核表达系统,具有强大的蛋白修饰与加工能力,分泌蛋白也较易分离和纯化,且适宜扩大为工业规模。根据已得到的HWTX-Ⅺ基因的cDNA序列设计引物,通过PCR方法获得目的基因,并克隆进质粒pPIC9K中转化Top10F’菌后,阳性克隆经菌落PCR鉴定插入方向后送测序证实已成功构建好重组质粒pPIC9K-HWTX-Ⅺ；利用BglⅡ将pPIC9K-HWTX-Ⅺ线性化后转化酵母宿主菌GS115,所有阳性克隆经G418梯度筛选后获得多拷贝转化子GS115-pPIC9K-HWTX-Ⅺ,经表型鉴定为His+ Muts酵母菌；将转化子GS115-pPIC9K-HWTX-Ⅺ用0.5%的甲醇诱导表达,表达上清经Tricine-SDS-PAGE鉴定有分子量6.7KD左右的目的蛋白。通过离子交换层析和反相高效液相色谱脱盐,获得了高纯度的重组克胰素,质谱鉴定分子量为6704,是正确的表达产物；采用分光光度计的方法比较了重组克胰素及天然克胰素对胰蛋白酶抑制活性的大小；实验求出重组克胰素及天然克胰素抑制胰蛋白酶的Ki值都处于同一个数量级,这说明HWTX-Ⅺ在毕赤酵母中得到了正确表达、加工及分泌。本论文对毕赤酵母表达重组克胰素的摇瓶发酵条件进行了优化,将培养温度、诱导甲醇浓度和培养基起始pH设计了三因素四水平的正交实验。结果表明,以上条件对于重组克胰素的表达量有明显影响,在优化条件下（28℃、甲醇2%、pH4.0）表达量为25.6mg/ml。此外,在摇瓶基础上开展了发酵罐的小试研究,尝试着从发酵培养基和发酵工艺两个方面逐一摸索发酵的最佳条件,提高重组克胰素的表达量。综上所述,利用毕赤酵母表达重组克胰素可以很大程度上提高其表达量,且能够进行工业化生产,为以HWTX-Ⅺ为先导分子研发急性胰腺炎治疗药物奠定基础。

论文目录

• 中英文缩略词表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 毕赤酵母表达外源基因的研究
• 1.1 毕赤酵母表达系统的特点
• 1.1.1 毕赤酵母表达的宿主菌
• 1.1.2 毕赤酵母的表达载体
• 1.2 实验流程
• 1.2.1 克隆
• 1.2.2 转化
• 1.2.3 筛选
• 1.2.4 表型鉴定
• 1.2.5 诱导表达
• 1.3 外源蛋白表达的影响因素及策略
• 1.3.1 表达载体系统
• 1.3.2 外源基因的性质
• 1.3.3 培养条件
• 1.3.4 蛋白酶的降解
• 1.3.5 发酵参数
• 1.4 应用前景与展望
• 1.5 本论文研究的背景和意义
• 第二章 HWTX-Ⅺ的毕赤酵母表达及活性鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 载体与菌株
• 2.1.2 试剂及其它材料
• 2.1.3 表达培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 基因的克隆
• 2.2.3 酵母的转化
• 2.2.4 多拷贝转化子的筛选及鉴定
• 2.2.5 融合蛋白的表达及电泳鉴定
• 2.2.6 蛋白纯化与鉴定
• 2.2.7 重组克胰素的胰蛋白酶抑制结果
• 2.3 结果
• 2.3.1 表达载体构建
• 2.3.2 酵母转化、筛选及表型鉴定
• 2.3.3 重组克胰素的表达与鉴定
• 2.3.4 重组克胰素的分离与纯化
• 2.3.5 重组克胰素的胰蛋白酶抑制活性
• 2.4 讨论
• 第三章 rHWTX-Ⅺ的摇瓶表达条件优化
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 试剂及其它材料
• 3.1.3 培养基
• 3.2 方法
• 3.2.1 菌种保藏
• 3.2.2 种子活化
• 3.2.3 单因素对HWTX-Ⅺ发酵的影响
• 3.2.4 正交实验
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 诱导温度对HWTX-Ⅺ发酵的影响
• 3.3.2 诱导起始pH对HWTX-Ⅺ发酵的影响
• 3.3.3 甲醇终浓度对HWTX-Ⅺ发酵的影响
• 3.3.4 正交实验结果
• 3.3.5 最佳收样时间的确定
• 3.3.6 溶氧量对HWTX-Ⅺ发酵的影响
• 3.4 讨论
• 第四章 rHWTX-Ⅺ的10L发酵罐小试初步研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料
• 4.2.1 菌株
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 实验仪器及设备
• 4.3 方法
• 4.3.1 培养方法
• 4.3.2 各项指标测定
• 4.3.3 发酵工艺路线
• 4.4 结果
• 4.4.1 不同培养基对发酵的影响
• 4.4.2 发酵工艺的确定
• 4.4.3 发酵周期
• 4.5 讨论
• 参考文献
• 致谢