类胡萝卜素对成骨细胞代谢的调控研究

论文摘要

目的骨折愈合及骨代谢消长是国际骨科学领域中最为关注的一大类健康问题。中医学认为,骨生长发育强劲衰弱与肾精盛衰关系密切。肾后天之精来源于脾精的滋养,故脾精不足,肾精亏虚,骨骼失养。而肾主骨生髓,髓生精血互化,血液运行濡养赖于肾精元气的蒸腾气化推动。若肾精不足,可致气化失源,无力温育激发推动脏气,气机升降出入失常,血失流畅,脉道涩滞乃至血瘀,反之血瘀有加重肾虚,因此骨折愈合、骨的消长主要与肾虚、脾虚、血瘀有关,以补肾、健脾、活血为原则;而活性氧与中医证型关系的研究发现,肾虚、脾虚、血瘀均与活性氧代谢有关,因此中药干预骨折愈合、骨代谢疾病（如骨质疏松症、关节性疾病等）的作用机理可能与中药某些具有较强清除活性氧功能的成分有关。类胡萝卜素是一大类广泛分布、具极强抗氧化功能的化合物,属食药兼顾类化合物,其对自由基（尤其是O2-、OH-、1O2）的淬灭能力远远强于维生素E。虽然类胡萝卜素研究始于19世纪50年代,而在其与骨折愈合、骨代谢方面的研究一直无人问津。上世纪90年代虽有关维生素A干预骨代谢的零星临床报道,但直到2005年国际类胡萝卜素科学年会上发表了一篇有关类胡萝卜素与骨健康基础研究报告后,世界机构才开始关注这一领域中基础性理论研究。就国内此类研究而言,尤其是类胡萝卜素中非维生素A源类化合物对骨折愈合、骨代谢调控的研究尚无报道。本课题研究目的通过从整体（D-半乳糖致衰老Wistar大鼠模型）-细胞（M3T3-E1成骨细胞模型）-分子（成骨细胞DNA）三个水平层次、结合体内（in vivo）-体外（in vitro）试验研究不同分子结构类胡萝卜素（β,β-胡萝卜素、虾青素、番茄红素、斑蝥黄质、玉米黄素、叶黄素）顺/反式异构体对不同类型自由基（O2-、OH-、1O2）淬灭的效果,同时从基因、蛋白质水平探索性研究了非维生素A源类胡萝卜素（虾青素、番茄红素、斑蝥黄质）对成骨细胞增殖与分化的调控机理,为进一步搞清此类化合物对骨代谢消长、骨折愈合干预作用可能的机理提供实验依据,并为开发应用防治此类骨病的中药复方开辟新的途径。研究内容与方法（1）制备、纯化、鉴定6种不同类胡萝卜素反式单体（2）体外诱导类胡萝卜素反式单体异构化为不同顺式单体（3）不同类胡萝卜素反式单体灌喂D-半乳糖致衰大鼠,对动物整体抗氧化能力;各脏器分布情况（含量、异构体比例等）、抗氧化指标;血清代谢动力学;骨代谢相关实验指标（股骨长度、重量、骨密度、骨钙、骨磷、骨镁、骨锰、羟脯氨酸含量、血钙、血磷含量、ALP活性、骨的结构力学和生物力学特点等）进行测定（4）不同类胡萝卜素反式单体处理H2O2损伤的M3T3-E1成骨细胞,对细胞存活率、SOD酶活性、ROS、LOP总量、DNA损伤以及细胞膜生物物理特性参数等进行测定（5）利用化学发光法、生物微弱发光法进行不同类胡萝卜素顺/反式单体体外淬灭不同自由基（O2-、OH-、1O2）效果的测定（6）不同非维生素A源类胡萝卜素反式单体（虾青素、斑蝥黄素、番茄红素）处理M3T3-E1成骨细胞,对细胞增殖、分化、DNA含量、蛋白质含量、ALP活性以及关键代谢调控基因（ALP、CollagenⅠ、RUNX2、TGFβ1、VEGF、BMP2、IGF-I、OPG、RANKL、RXR）进行测定结果（1）整体水平:将制备得到的β,β-胡萝卜素、虾青素、番茄红素、斑蝥黄质、玉米黄素、叶黄素反式单体分别灌喂D-半乳糖致衰老大鼠后,可以有效地降低血清TC、TG、LDL-c、TC/HDL-c、LDL-c/HDL-c及各脏器的MDA,升高血清、各脏器的SOD、GSH-Px酶活性,提高机体总抗氧化能力。同时也可增加D-半乳糖致衰老大鼠的股骨长度、重量和骨密度,提高重要的骨矿物质（钙、磷、镁、锰）、羟脯氨酸含量及其ALP活性,影响血钙、磷的含量,改善骨的结构力学和生物力学特点,减少衰老过程自由基对骨代谢的不良影响。（2）细胞水平:β,β-胡萝卜素、虾青素、番茄红素、斑蝥黄质、玉米黄素、叶黄素反式单体可有效地抑制H2O2对成骨细胞膜的损伤,降低细胞ROS、LPO含量,增加SOD酶活性,减少DNA损伤,提高细胞的存活率。实验发现,虾青素、斑蝥黄质和番茄红素在基因表达水平上对成骨细胞ALP、CollagenⅠ、RUNX2、TGFβ1、VEGF、BMP2、IGF-I、OPG、RANKL均有调控作用,在蛋白质水平对ALP、OPG以及总蛋白含量积累也有上调影响,且与相应的mRNA水平基本一致。此外,在调控RXR受体表达方面,3种类胡萝卜素与维生素A存在差异,这意味着非维生素A源类胡萝卜素化合物可能会在成骨细胞膜上与某一特异性受体识别结合,进入细胞代谢途径,激活或抑制某些关键性基因,对成骨细胞增殖与分化过程产生影响。同时由于3种类胡萝卜素吸收与维生素D吸收对于RXR受体不存在竞争,因此其摄入可能不会导致后者吸收障碍。（3）分子水平:制备得到的β,β-胡萝卜素、虾青素、番茄红素、斑蝥黄质、玉米黄素、叶黄素反式单体以及体外碘诱导下得到的不同顺式异构体对不同自由基（O2-、OH-、1O2）均有良好的淬灭效果,但就淬灭自由基类型而言:1O2＞OH-＞O2-;就类胡萝卜素反式单体淬灭能力而言:番茄红素＞虾青素＞斑蝥黄质＞叶黄素＞玉米黄素＞β,β-胡萝卜素;就类胡萝卜素顺/反式单体淬灭能力而言:类胡萝卜素反式单体＞13-顺式异构体＞11-顺式异构体＞9-顺式异构体。此外,在体外不同类胡萝卜素对成骨细胞DNA的复制具有一定的促进作用,同时可有效地减低自由基对DNA的损伤影响。结论（1）成功制备得到6种不同类胡萝卜素的顺/反式单体（2）成功建立一套整体、细胞、分子研究不同类胡萝卜素顺/反单体抗氧化、淬灭自由基的研究系统（3）首次成功地从基因、蛋白质水平上,就非维生素A源类胡萝卜素参与成骨细胞代谢调控进行了探索性研究

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略语
• 前言
• 研究背景
• 特色与创新
• 实验思路与技术路线
• 第一部分 类胡萝卜素的提取、分离、纯化研究
• 1.材料与仪器
• 2.实验方法
• 3.结果与讨论
• 4.结论
• 第二部分 类胡萝卜素抗氧化实验
• 2.1 动物整体水平抗氧化实验
• 1.材料与仪器
• 2.实验方法
• 3.结果与讨论
• 4.结论
• 2.2 细胞水平抗氧化实验
• 1.材料与仪器
• 2.方法
• 3.结果与讨论
• 4.结论
• 2.3 分子水平抗氧化实验
• 1.材料与仪器
• 2.方法
• 3.结果与讨论
• 4.结论
• 第三部分 不同类胡萝卜素对成骨细胞生长与分化的影响
• 1.材料与仪器
• 2.方法
• 3.结果与讨论
• 4.结论
• 结论
• 展望
• 文献综述
• 1 类胡萝卜素的研究进展
• 2 活性氧与骨代谢的关系
• 3 骨折愈合过程中细胞因子基因表达研究进展
• 4 Vitamin A、Vitamin D与成骨细胞的研究进展
• 参考文献
• 致谢
• 学习期间（2005-2007）发表论文