骨髓基质细胞脑内移植治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的时间窗探讨

论文摘要

新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE）是导致儿童神经系统伤残,如脑瘫、精神发育迟滞、学习障碍和癫痫的重要原因。尽管近年来围产医学取得了很大进展,医疗条件也在不断改善,但HIE仍缺乏有效治疗,中重度HIE患儿后遗症的发生率和病死率仍较高。如何改善HIE患儿的预后,降低其后遗症的发生率是当前儿科医生面临的一大难题。干细胞移植在动物实验及部分临床实验的成功结果,为临床神经系统疾病的治疗带来了曙光。干细胞的研究主要基于成年大鼠大脑中动脉缺血模型（MCAO）,与儿童和新生儿的相关研究较少。近年来,用神经干细胞和骨髓基质细胞（bonemarrow stromal cells,BMSCs）移植治疗新生动物缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）也取得了一定的效果,为临床干细胞移植治疗新生儿HIE带来了福音。干细胞移植治疗脑损伤的最适宜的时间仍在探索中。脑损伤后的病理生理是一个复杂的过程,一方面,兴奋性神经递质、自由基及前炎症介质的释放进一步加重脑损伤,而与此同时,机体启动内源性修复机制,减轻损伤程度。在脑损伤的急性期,由于兴奋性神经递质、自由基及前炎症介质的释放不利于干细胞的存活;而在损伤后较晚移植,则处于疤痕组织的形成阶段,对移植细胞的存活、迁移、分化也产生不利的影响。选择合适的时机进行移植,充分利用脑损伤后内在的修复机制,使移植达到最佳效果,是移植领域中需要考虑的问题,近年来也引起了关注。Iihoshi等在成年大鼠MCAO模型制作后3～72h进行自体BMSCs静脉移植,结果发现3 h移植组能明显缩小脑梗死体积,改善行为学,认为MCAO后早期进行移植效果最好;Hofstetter在骨髓MSCs移植对脊髓损伤的修复作用的研究中发现,损伤后一周移植较损伤后立即移植的骨髓MSCs的存活率及神经分化率高。这些均为成年动物模型的研究,至今尚无关于新生动物HIBD模型研究的报道。新生动物脑仍处于发育的关键期,脑在结构和功能上也与成年脑不同,比成年脑有更强的可塑性,因此对新生儿脑损伤移植时间窗的探讨较成年脑损伤移植时间窗的研究更有必要。中枢神经系统的可塑性和功能重建是一复杂过程,目前认为干细胞改善脑损伤的神经功能是通过多种途径完成的。（1）干细胞向神经细胞分化后的直接替代作用。BMSCs具有多向分化潜能,在不同的诱导条件下能向多种细胞系分化。诱导BMSCs向神经细胞分化的研究中,因所采用的诱导方法不同,神经细胞的分化率以及存活时间有明显差别,提示BMSCs所处的环境对其分化起着决定性作用。在体内,干细胞分化为神经元的分化率各研究报道不一。（2）分泌神经营养因子。在干细胞治疗缺氧缺血性脑损伤的机制研究中,众多的结果证实BMSCs能合成多种神经生长因子,干细胞通过分泌细胞因子,减少脑损伤后的神经细胞凋亡、促进内源性神经干细胞的神经分化,减轻脑白质损伤从而对缺氧缺血性脑损伤起到全面的保护作用。本研究在新生大鼠HIBD后24 h、72 h、7d用同种异体BMSCs脑内移植,分以下3个部分进行研究,探讨新生大鼠HIBD后最适宜的移植时间窗,为BMSCs临床移植治疗提供理论基础。一、骨髓基质细胞不同时间移植对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠行为的影响目的:在动物实验及部分临床研究中已经证实BMSCs移植治疗HIBD是有效的,动物实验中大部分研究选择在缺氧缺血性脑损伤后24 h、3 d及72 h,最佳移植时间点尚无定论。本研究在新生大鼠HIBD后不同时间点移植,通过对远期行为学测试,探讨最佳移植时间窗。方法:55只7日龄SD新生大鼠随机分为正常对照组（n=10）、HIBD组（n=12）、24 h移植组（n=12）、72 h移植组（n=11）及7d移植组（n=10）,HIBD组和各移植组大鼠结扎左颈总动脉后置于8%的低氧环境制作HIBD模型,移植组大鼠分别在HIBD后24 h、72h及7 d,在大鼠脑立体定位仪下,将体外培养3～5代的SD大鼠BMSCs脑内移植于左侧海马,分别在日龄32天、40天、42天时进行T迷宫强迫改变、放射形迷宫觅水及运动感觉功能测试。结果:HIBD组大鼠各组测试结果均明显差于正常组,差异有显著意义（P＜0.01）,24 h、72 h及7 d移植组T迷宫强迫改变及放射形迷宫觅水实验结果较HIBD组有明显改善,其差异有显著意义（P＜0.05）,其中24 h移植组感觉运动功能测试较HIBD组有改善（P＜0.05）。结论:HIBD后24 h、72 h及7 d移植均能改善远期行为学结果,以HIBD后24h移植疗效最好。二、新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后不同时间脑组织上清液诱导骨髓基质细胞向神经细胞分化目的:已有研究证实BMSCs移植治疗HIBD是有效的,其治疗机制之一为BMSCs向神经细胞分化后的替代作用,微环境对其分化方向起着至关重要的作用。HIBD后何时的微环境最有利于移植的BMSCs分化成为神经细胞,目前尚不清楚。如果能弄清这一点,将有利于帮助脑损伤后的修复和提高移植效果。本研究通过HIBD大鼠不同时间点的脑组织上清液与BMSCs共培养,观察其对BMSCs向神经细胞分化的影响,以探讨脑损伤后最有利于神经细胞增殖分化的时间点,为BMSCs移植治疗的最佳时间窗的选择提供依据。方法:33只7日龄SD新生大鼠随机分为正常对照组（n=15）和HIBD组（n=18）,HIBD组大鼠结扎左颈总动脉后置于8%的低氧环境制作HIBD模型,分别在HIBD后24 h（8日龄）、72 h（10日龄）及7 d（14日龄）时随机处死5只（n=5）。正常对照组在各相应时间点处死,各时间点5只（n=5）。分别制备左、右脑组织上清液。将培养3～5代的SD大鼠BMSCs接种于预先置有盖玻片24孔板中,正常培养至细胞达到60%～70%融合后,分别加入上述不同时间点的脑组织上清液共培养,另正常换液未加上清液组为未干预组。培养3天后行神经元特异性烯醇酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、未成熟少突胶质细胞标记（O4）免疫荧光检测,计算阳性率,实验重复3次。结果:未干预各组BMSCs细胞仅有少量NSE、GFAP及O4的表达,正常大鼠各时间点左、右脑上清液共培养各组BMSCs细胞NSE、GFAP及O4阳性率较未干预组增加（均P＜0.01）,但左、右两侧比较差异无显著性（P＞0.05）。HIBD后24 h组、72 h组左脑上清液共培养组BMSCs细胞NSE、O4的阳性率明显增加,分别与同时间点右侧（未结扎侧）及正常组同一时间点的左、右侧比较,差异有显著意义（P＜0.05或0.01）,HIBD后7 d左、右脑上清液共培养组BMSCs细胞NSE、GFAP及O4的阳性率相近,分别与正常组同一时间点比较差异无显著性（均P＞0.05）。HIBD后24 h组左脑上清液共培养组BMSCs细胞NSE、O4的阳性率较HIBD后72 h组及7 d组左脑上清液共培养组BMSCs细胞NSE、O4的阳性率高,差异均有显著意义（P＜0.01）。结论:正常鼠、HIBD鼠脑上清液均能诱导BMSCs发生神经分化,以HIBD后24 h损伤侧脑上清液对BMSCs的神经分化率最高。三、骨髓基质细胞不同时间移植对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠保护作用的机制探讨目的:BMSCs治疗HIBD是通过多种机制完成的。本研究在新生大鼠HIBD后24 h、72 h、7 d用BMSCs进行脑内移植,观察BMSCs在脑内的神经分化、对神经细胞的保护及抗凋亡作用以及对缺氧缺血性脑白质损伤的保护作用,从机制方面探讨新生大鼠HIBD后何时接受移植能起到更好的效果。方法:80只7日龄SD新生大鼠随机分为正常对照组（n=15）、HIBD组（n=17）、24 h移植组（n=17）、72 h移植组（n=16）及7 d移植组（n=15）,HIBD组和各移植组大鼠结扎左颈总动脉后置于8%的低氧环境制作HIBD模型。移植组大鼠分别在HIBD后24 h、72 h及7 d,在大鼠脑立体定位仪下,将体外培养3-5代的SD大鼠BMSCs用Hochest33324标记24 h后脑内移植于左侧海马。日龄21天时,每组处死5只大鼠,用TUNEL法进行细胞凋亡的检测。日龄45天时（行为学测试后）,处死大鼠,取脑组织行尼氏染色,计数左侧（损伤侧）海马CA1区和皮质神经元数,行髓鞘碱性蛋白（MBP）检测左侧（损伤侧）胼胝体和皮质下白质MBP表达,行O4免疫组织化学检测左侧侧脑室周围和皮质下白质O4的表达。用荧光显微镜观察BMSCs在脑组织中的存活、增殖及BMSCs的NSE、GFAP和O4的阳性表达。结果:与对照组比较,HIBD组左侧（损伤侧）相同部位TUNEL阳性细胞数明显增多,神经元数明显减少,MBP染色变浅,有不同程度的髓鞘脱失改变,O4阳性细胞数较对照组明显减少,差异均有显著意义（P＜0.01）。HIBD后24 h、72 h及7 d用BMSCs脑内移植能减少TUNEL阳性细胞数、增加神经元数、增加MBP免疫染色及O4阳性细胞数,与HIBD组比较,差异均有显著意义（P＜0.01）。其中24 h移植组在减少TUNEL阳性细胞数、增加神经元数及O4阳性细胞数方面与72 h及7 d移植组比较,差异有显著意义（P＜0.05或P＜0.01）,后两组比较差异无显著性（P＞0.05）。24 h移植组和72 h移植组MBP染色较7 d移植组明显增加,其差异有显著意义（P＜0.05或P＜0.01）。BMSCs脑内移植后30～40天,移植部位及左侧皮层区（损伤侧）均可见到胞核蓝色的BMSCs,右侧脑内（非损伤侧）仅见散在BMSCs分布。Hochest33324标记细胞部分表达NSE,GFAP和O4。24h移植组NSE阳性表达率高于72 h及7 d移植组,72 h移植组NSE阳性表达率高于7 d移植组,其差异均有显著意义（P＜0.01）,三组之间GFAP和O4表达率的差异无显著性（P＞0.05）。结论:新生大鼠HIBD后24 h、72 h和7 d用BMSCs海马移植,能通过保护神经元、减轻神经细胞凋亡、促进脑白质损伤的修复等多种机制对HIBD起着全面的保护作用,其中HIBD后24 h最有利于促进BMSCs向神经元的分化,减轻凋亡,促进脑白质修复。本研究结论如下:1.新生大鼠HIBD后24 h、72 h和7 d用BMSCs海马移植,能通过保护神经元、减轻神经细胞凋亡、促进脑白质损伤的修复等多种机制对HIBD起着全面的保护作用,其中HIBD后24 h能最大程度促进BMSCs向神经元的分化,减轻凋亡,促进脑白质修复,能最大程度改善远期行为学结果。2.正常鼠、HIBD鼠脑上清液均能诱导BMSCs发生神经分化,以HIBD后24 h损伤侧脑上清液对BMSCs的神经分化率最高。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词表
• 第一部分 骨髓基质细胞不同时间移植对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠行为的影响
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 第二部分 新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后不同时间的脑组织上清液诱导骨髓基质细胞向神经细胞分化
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 第三部分 骨髓基质细胞不同时间点移植对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠的保护作用
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 综述一
• 综述二
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果