FOXA1在急性肺损伤肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡中的作用

论文摘要

急性肺损伤（acute lung iniury,ALI）和急性呼吸窘迫综合征（acuterespiratory distress syndrome,ARDS）多由严重创伤、感染、胃酸吸入、脂肪栓塞等引起。虽然其发病机制迄今尚未完全阐明,但多种病因引起肺泡上皮细胞的过度凋亡所致的呼吸膜损伤在其发病学中的重要作用已受到广泛关注。FoxA1（forkhead box A1）是Fox A翼状螺旋转录因子家族成员之一。FoxA1能够与下游基因启动子区的FoxAl结合元件相结合,从而调控这些基因的表达。通过对下游基因表达的调控,FoxA1在正常细胞的增殖和分化、肝、肺、前列腺、卵巢等器官胚胎发育以及肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。但是FoxA1与ALl及肺泡上皮细胞凋亡之间有何关系,至今尚未见报道。本实验室在前期工作中采用cDNA微阵列检测了LPS诱导的ALl小鼠肺组织基因表达谱的变化,发现FoxA1基因在注射内毒素2小时的小鼠肺组织中表达上调;注射内毒素20小时后,FoxA1基因的表达水平进一步增高,达正常水平10倍以上,但对其在内毒素血症及ALl发病中有何意义仍不清楚。为了观察FoxA1在ALI中的表达模式,本研究第一部分采用SD大鼠尾静脉注射油酸（oleic acid,OA,0.1ml/kg）、腹腔注射LPS（15mg/kg）和气管内滴注LPS（2mg/kg）制备大鼠ALI模型。用肺湿/干重比例和肺损伤评分评估ALI程度。另一方面,采用过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2,0.5mM）、LPS（1000ng/ml）、TNF-α（10ng/ml）刺激原代培养的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞和A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞株制备体外细胞损伤模型。采用RT-PCR和Western blot分别检测了FoxA1 mRNA和蛋白质在SD大鼠ALI肺组织和肺泡Ⅱ型上皮细胞急性损伤中的表达情况。结果发现多种原因所致ALI大鼠肺组织和急性肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤中FoxA1表达显著上调。以上结果提示:FoxA1可能是一个在ALI中起重要作用的转录因子。同时,采用生物信息学分析显示多个细胞凋亡相关基因启动子区含有FoxA1结合元件,作为在ALI中表达增加的转录因子,它对细胞凋亡相关基因表达调控的可能引起了我们的关注。为了观察FoxA1是否对ALI所致肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡具有调控作用,本研究第二部分首先对ALI大鼠肺组织的caspase3进行了检测,同时对ALI大鼠肺组织切片进行了TUNNEL和MNF116免疫组化共染色实验。结果表明,ALI大鼠肺组织中caspase3活性上调,ALI大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞发生凋亡。另一方面,将分离的原代SD大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞以及A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞株暴露于H2O2诱导细胞急性损伤,采用流式细胞术检测细胞凋亡,发现H2O2导致细胞凋亡率显著上升。为探讨FoxA1在ALI时肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡中的可能作用,我们构建了FoxA1过表达的A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞株,并采用反义寡核苷酸技术建立了内源性FoxA1表达抑制的模型,采用流式细胞术观察FoxA1对H2O2所致肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响。结果显示,FoxA1过表达导致H2O2所致的肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率上升,而内源性FoxA1表达抑制则导致H2O2所致的肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率下降。上述结果表明FoxA1能促进H2O2所致的肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡。为深入研究FoxA1调控肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的机制,首先采用生物信息学技术对凋亡相关基因启动子区进行了分析,并采用RT-PCR进行筛选,发现促凋亡基因bcl2和UCP2可能受到FoxA1的调控。然后,本研究进一步观察了FoxA1对这两个基因表达的影响,并对其调控机制进行了探讨,获得了以下实验结果:（1）FoxA1对H2O2刺激下bcl2和UCP2 mRNA表达具有抑制作用。H2O2刺激后,bcl2和UCP2的mRNA表达明显升高;FoxA1过表达明显抑制了H2O2诱导的bcl2和UCP2 mRNA的表达;而FoxA1内源性抑制则促进bcl2和UCP2 mRNA表达。（2）FoxA1抑制H2O2所致bcl2和UCP2蛋白质的表达。H2O2刺激后,bcl2和UCP2的蛋白表达明显升高;FoxA1过表达明显抑制了H2O2诱导的bcl2和UCP2蛋白的表达;而FoxA1内源性抑制则促进bcl2和UCP2蛋白的表达。（3）H2O2促进FoxA1与bcl2和UCP2基因启动子区的结合活性。在正常状态下FoxA1能够与bcl2基因启动子区-538～-532bp、-280～-272bp和UCP2基因启动子区-919～-913bp结合,H2O2能够促进此结合活性的增强。（4）FoxA1能抑制H2O2所致bcl2和UCP2基因启动子转录活性的增强。FoxA1能够抑制正常状态下bcl2和UCP2基因启动子的转录活性,并明显抑制H2O2所致的bcl2和UCP2基因启动子转录活性的增强。上述结果表明,FoxA1通过抑制抗凋亡基因bcl2和UCP2的表达而促进肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡,可能在ALI所致肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡中发挥重要作用。综上所述,本研究发现了FoxA1的一个新功能,即FoxA1在ALI大鼠肺组织及肺泡Ⅱ型上皮细胞中表达上调,FoxA1通过与促凋亡基因bcl2和UCP2启动子区的FoxA1结合元件相结合来抑制其表达,从而促进肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡,在ALI中发挥作用。上述研究揭示了FoxA1在ALI所致肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡中的作用,为揭示ALI的发病机制提供了新的实验依据,也为深入探讨FoxA1的生物学功能和ALI的防治提供了新的线索。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 技术路线
• 第一章 急性肺损伤和肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤对FoxA1 mRNA和蛋白质表达的影响
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.1.1 动物
• 1.1.1.2 细胞株
• 1.1.1.3 抗体
• 1.1.1.4 其它主要试剂
• 1.1.1.5 主要仪器
• 1.1.1.6 引物
• 1.1.2 方法
• 1.1.2.1 大鼠急性肺损伤模型制备
• 1.1.2.2 肺组织损伤评分
• 1.1.2.3 肺组织湿/干重比例测定
• 1.1.2.4 SD大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离及培养
• 1.1.2.5 细胞培养及处理
• 1.1.2.6 组织和细胞总RNA的提取
• 1.1.2.7 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）
• 1.1.2.8 免疫印迹分析（Western blot）
• 1.1.2.9 统计学分析
• 1.2 结果
• 1.2.1 急性肺损伤大鼠血气分析、肺组织形态学变化
• 1.2.2 急性肺损伤SD大鼠肺组织损伤程度及肺湿/干重比例
• 1.2.3 急性肺损伤时FoxA1在SD大鼠肺组织中的表达
• 1.2.4 多种损伤因素对原代分离培养的SD大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞FoxA1表达的影响
• 1.2.5 多种损伤因素对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞FoxA1表达的影响
• 1.3 分析与讨论
• 1.4 小结
• 第二章 FoxA1对急性肺损伤中肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 主要材料和试剂
• 2.1.1.2 主要仪器
• 2.1.1.3 引物及寡核苷酸序列
• 2.1.1.4 其它材料同第一部分
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 细胞培养及处理
• 2.1.2.2 caspase3活性检测
• 2.1.2.3 TUNNEL和MNF-116双标检测肺组织肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡
• 2.1.2.4 pcDNA3.1-FoxA1真核表达质粒构建
• 2.1.2.5 脂质体介导的瞬时转染
• 2.1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡
• 2.1.2.7 其它方法同第一部分
• 2.2 结果
• 2.2.1 急性肺损伤SD大鼠肺组织caspase-3活性的变化
• 2.2.2 急性肺损伤对SD大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响
• 2O₂对肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响'>2.2.3 H₂O₂对肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响
• 2O₂诱导原代分离培养的SD大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡'>2.2.3.1 H₂O₂诱导原代分离培养的SD大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡
• 2O₂诱导A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡'>2.2.3.2 H₂O₂诱导A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡
• 2.2.4 pcDNA3.1-FoxA1重组质粒的构建
• 2.2.5 FoxA1过表达的A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞的鉴定
• 2.2.6 内源性FoxA1的表达抑制
• 2.2.6.1 FoxA1反义寡核苷酸对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞内源性FoxA1 mRNA表达的影响
• 2.2.6.2 FoxA1反义寡核苷酸对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞内源性FoxA1蛋白表达的影响
• 2O₂诱导的A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响'>2.2.7 FoxA1对H₂O₂诱导的A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响
• 2O₂诱导的A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响'>2.2.7.1 FoxA1过表达对H₂O₂诱导的A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响
• 2O₂诱导的A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响'>2.2.7.2 FoxA1内源性表达抑制对H₂O₂诱导的A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响
• 2.3 分析与讨论
• 2.4 小结
• 第三章 FoxA1对凋亡相关基因bcl2和UCP2表达的影响及其机制探讨
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 主要材料和试剂
• 3.1.1.2 主要仪器
• 3.1.1.3 引物及寡核苷酸序列
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 细胞培养及处理
• 3.1.2.2 免疫印迹分析（Western blot）
• 3.1.2.3 生物信息学数据分析
• 3.1.2.4 质粒构建
• 3.1.2.5 脂质体介导的瞬时转染
• 3.1.2.6 细胞核蛋白的提取
• 3.1.2.7 凝胶电泳迁移率分析（EMSA）
• 3.1.2.8 染色质免疫共沉淀分析（ChIP）
• 3.1.2.9 双荧光素酶报告基因分析
• 3.1.2.10 其他材料方法同前
• 3.2 结果
• 3.2.1 启动子区含有FoxA1结合元件的细胞凋亡相关基因的生物信息学分析
• 3.2.2 FoxA1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞中bcl2表达的影响
• 3.2.2.1 FoxA1过表达对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞中bcl2表达的影响
• 3.2.2.2 内源性FoxA1表达抑制对A549人肺泡Ⅱ型上皮bcl2表达的影响
• 3.2.3 FoxA1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞中UCP2表达的影响
• 3.2.3.1 FoxA1过表达对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞中UCP2表达的影响
• 3.2.3.2 内源性FoxA1表达抑制对UCP2表达的影响
• 3.2.4 FoxA1调控bcl2和UCP2表达的机制
• 3.2.4.1 人bcl2和UCP2基因启动子的生物信息学分析
• 3.2.4.2 FoxA1与bcl2和UCP2基因启动子区FoxA1元件的结合
• 3.2.4.3 FoxA1对bcl2和UCP2基因启动子转录活性的影响
• 3.3 分析与讨论
• 3.4 小结
• 讨论
• 总结论
• 参考文献
• 综述
• 攻读学位期间主要的研究成果目录
• 致谢