肝窦状内皮细胞分离纯化和永生化

论文摘要

目的：建立小鼠肝窦状内皮细胞（sinusoidal endothelial cells, SEC）的分离培养方法,研究其生物学特性。方法：中性蛋白酶（dispase）消化小鼠肝组织,Percoll密度梯度离心分离消化后的细胞悬液,用内皮细胞选择培养基及酶差异消化法纯化SEC；免疫细胞化学染色检测SEC的表面标志,电镜分析SEC的超微结构,观察DiI荧光标记的乙酰低密度脂蛋白（Acetylated-Low Density Lipoprotein, DiI-Ac-LDL）摄取能力以及体外成血管能力分析SEC的功能。结果：分离纯化后的细胞呈典型鹅卵石样内皮细胞形态,这些细胞表达内皮细胞特征性标志vWF,但不表达CD31以及间质细胞和上皮细胞的表面标志,具有窦状内皮细胞特征性的窗孔结构,Weibel-Palade小体；能摄取DiI-Ac-LDL,并有一定的成血管能力。结论：建立了一种分离、培养SEC的方法,为研究SEC的功能奠定了基础。目的：研究自发永生化肝窦状内皮细胞生物学特性方法：5-溴-4氯-3-吲哚基-β-d-半乳糖苷（X-gal）染色检测衰老相关的β-半乳糖苷酶(senescence-associated (3-galactosidase SA-（3-Gal）活性。免疫细胞化学染色和流式细胞术检测永生化SEC的表面标志,细胞生长曲线分析永生化SEC的增殖能力。DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（Acetylated-Low Density Lipoprotein, DiI-Ac-LDL）摄取能力、体外成血管能力分析永生化SEC的功能。染色体核型分析永生化SEC遗传稳定性；软琼脂体外培养、SCID小鼠体内接种观察永生化SEC体内外成瘤性,Western blot分析永生化SEC P53蛋白表达水平的改变。结果：在体外培养8代后,SEC发生衰老。衰老细胞继续培养约40天左右,衰老细胞层上出现新的圆形、折光性强的新生细胞,这些细胞呈克隆性、多层生长,且随传代次数的增加,增殖能力增强,与永生化细胞特性一致。表达内皮细胞特征性标志物vWF和CD31,也表达间质细胞标志CD90、CD105和desmin;能摄取DiI-Ac-LDL,但失去成血管能力；体内外均无成瘤性,P53蛋白表达明显增加。结论：肝窦状内皮细胞在体外培养条件下自发永生化。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 专业名称缩写中英文对照表
• 技术路线
• 前言
• 第一章 小鼠窦状内皮细胞分离方法
• 1 材料和方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 肝窦状内皮细胞分离
• 2.2 肝窦状内皮细胞纯化
• 2.3 SEC免疫表型分析
• 2.4 SEC功能分析
• 2.5 SEC膜表面具有典型的窗孔样结构
• 2.6 SEC内含有W-P小体
• 3 讨论
• 4 结论
• 附图
• 第二章 永生化窦状内皮细胞的生物学特性
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 SEC衰老检测及细胞状态
• 2.2 永生化SEC免疫表型分析
• 2.3 永生化SEC功能分析
• 2.4 永生化SEC膜表面没有窗孔样结构
• 2.5 永生化SEC染色体数量及普通G显带核型均保持正常
• 2.6 永生化窦状内皮细胞体内体外均无成瘤作用
• 2.7 永生化前后窦状内皮细胞P53蛋白表达增加
• 2.8 细胞生长曲线
• 3 讨论
• 4 结论
• 附图
• 总结
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 在读硕士期间成果
• 个人简历