NRSF参与间充质干细胞向神经元及胰岛细胞分化的研究

论文摘要

神经系统疾病和糖尿病仍是困扰人类健康的重要疾病,目前,细胞移植治疗是较为理想的治疗方法,然而移植细胞来源（例如神经元或胰岛）的匮乏限制了这一治疗手段的广泛开展。干细胞由于其具有自我更新及多向分化潜能为提供优良的种子细胞带来了新的希望。在众多干细胞中,骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）具有易于获取、多向分化能力、无伦理学争议、免疫排斥低等优点,是进行细胞移植的理想种子细胞。但是目前关于MSCs诱导分化为神经元或胰岛细胞仍然存在很多问题,如分化效率不高、分化细胞功能不完善、分化机制不明确等。进一步阐明MSCs向神经元和胰岛细胞分化的机制,提高诱导效率是本课题的研究目的。通过文献调研,我们发现神经元限制性沉默因子在干细胞向神经和胰岛分化过程中可能发挥了重要作用。神经元限制性沉默因子（neuronal restrictive silencing factor,NRSF）,也被称为REST（repressor element silencing transcription factor）,属于具有转录调控作用的Cys2-His2锌指蛋白Gli-Kruppel家族,是一个116kD的锌指蛋白。在NRSF的N端有八个锌指重复结构,其后紧随的区域为富含脯氨酸的重复结构,在C端还有一个锌指结构。缺失体及GAL-4融合分析证实NRSF有两个独立的阻遏区域,分别位于两端,NRSF锌指结构6～8主要发挥与靶基因DNA序列结合的功能,锌指结构2～5主要发挥核定位的作用。NRSF通过和一段称为NRSE（neuronal restrictive silencer element）的DNA序列结合,招募组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases,HDAC）使组蛋白去乙酰化从而抑制基因的表达,NRSF因此抑制多种神经元特异性基因的表达,包括离子通道、神经递质、生长因子、激素及调控轴突生长、囊泡运输及释放的因子等。NRSF广泛表达于胚胎干细胞及成体细胞中,仅在成熟神经元和胰岛细胞中没有表达。研究发现,NRSF在干细胞的干性维持及发育分化中有着重要作用,在神经干细胞中抑制NRSF的表达可以激活多种神经元特异表达的基因,这些基因的表达有助于促进干细胞向神经元分化。在小鼠神经母细胞瘤N18中采用RNA干涉的方法降低NRSF表达成功地诱导细胞产生神经突触。NRSF还可以通过抑制miRNA-21的表达来维持小鼠胚胎干细胞的自我更新能力和全能性。在神经发育过程中NRSF的表达下调具有重要意义,在神经元中外源性过表达NRSF将抑制神经元特异基因的表达并导致神经轴突导向错误。我们的研究发现MSCs高表达NRSF蛋白,提示NRSF可能在维持MSCs的干性中也发挥了作用。为进一步明确NRSF在MSCs分化中的作用,在本实验中,我们通过RNA干涉技术,下调MSCs内源NRSF表达进行并分析干涉NRSF后MSCs向神经元和胰岛细胞分化的能力。我们首先构建了能够稳定干涉人NRSF的慢病毒干涉载体,并在HeLa细胞中对其进行干涉效果和功能的鉴定。结果表明:所构建的干涉载体在HeLa细胞中能够稳定降低NRSF的mRNA和蛋白表达水平,干涉NRSF可以有效启动其靶基因如脑源性神经营养因子BDNF、神经元特异性生长相关蛋白SCG10、配对盒基因pax4以及胰岛素insulin等的表达。同时通过胰岛素基因启动子-萤火虫荧光素酶报告系统证实,干涉NRSF后胰岛素基因启动子的活性明显增强。在此基础上,我们利用NRSF慢病毒干涉载体感染MSCs,同样发现:NRSF慢病毒干涉载体能够降低MSCs中NRSF mRNA和蛋白水平的表达,通过脱靶对照实验证明这种干涉效果并未引起RNA干涉的脱靶效应。在MSCs的正常培养条件（低糖DMEM+10%胎牛血清）下,感染NRSF干涉病毒的MSCs（ MSCs-siNRSF ）生长速度明显低于感染脱靶对照病毒的MSCs（MSCs-siControl）。培养7天后可见MSCs-siNRSF生长出神经元样的突触结构,14天后,这些突触进一步伸展,细胞呈现神经元样的结构,而MSCs-siControl并无明显的形态变化。RT-PCR结果显示,分化后的MSCs-siNRSF表达SCG10、BDNF、突触素SYP、神经元烯醇化酶NSE和神经营养素NGN3,但不表达胶质纤维酸性蛋白GFAP。免疫荧光染色结果表明,分化细胞表达神经元特异蛋白如β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ）、NSE、BDNF和微管相关蛋白2（MAP2）等,但不表达GFAP和少突胶质细胞转录因子Olig2。更重要的是,膜片钳实验进一步证明了这些分化细胞具有TTX敏感的Na+电流和动作电位。上述结果表明,NRSF干涉可促进MSCs分化为不含胶质细胞的神经元样细胞,这些分化细胞不仅具有神经元样的形态,表达神经元特异性的蛋白,还具有神经元的功能。NRSF在胰腺发育可能也发挥着重要的作用。在胰岛素瘤细胞系中过表达NRSF会破坏其葡萄糖-胰岛素分泌偶联机制,而在胰岛β细胞中表达NRSF则导致葡萄糖耐受和β细胞数目减少。在本研究中,我们发现在胰高血糖素GLP-1、碱性成纤维细胞生长因子bFGF存在的条件下,干涉NRSF有助于MSCs分化为胰岛样细胞,这些分化细胞表达胰岛素mRNA,双硫腙（DTZ）染色阳性,但还需要进一步研究以确定其功能。综上所述,干涉NRSF能够使MSCs向神经元自发分化,在特定条件下,这些细胞能够分化为胰岛样的细胞。这些研究结果不仅有利于进一步分析NRSF在神经及胰岛发育中的机制,而且提供了一种产生神经元和胰岛细胞的新方法。

论文目录

• 缩略词表
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 一、神经元限制性沉默因子及其作用元件
• 二、NRSF 在神经发育中的重要作用
• 三、NRSF与胰岛细胞分化
• 四、研究方法与目的
• 五、论文的结构安排
• 第一部分 NRSF 慢病毒干涉载体的构建及检测
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 第二部分 干涉NRSF 促使MSCs 分化为神经元
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 第三部分 干涉NRSF 有助于MSCs 分化为胰岛细胞
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 主要仪器
• 主要试剂
• 个人简历
• 致谢