桃（Prunus persica）两种MADS box基因的克隆及其功能分析

论文摘要

了解植物由营养生长向生殖生长的转变的调节过程,对于控制有花植物的生长发育是很有意义的。至今已经鉴定了许多参与控制果实和花发育的MADS box基因。 MADS box基因多数是由M、I、K和C四个区域构成的,很少一些MADS box基因在M区上游还具有一段富含碱性氨基酸的N末端区域。其中M区高度保守,它编码真核生物转录因子的DNA结合域,具有DNA结合和二聚体形成的作用。经典的“ABC”模型中所涉及的MADS box基因有A、B、C三类功能,随后“ABC”模型不断得到充实和完善,D类和E类功能基因的出现壮大了MADS box基因家族,“ABCD”模型、“ABCDE”模型和“四聚体”模型相继涌现,使人们对花发育的机理有了更深入的了解。 近来的研究表明MADS box基因家族并不只在花器官的发育中起调控作用,MADS box基因在控制开花时间、决定分裂组织的分化、控制胚胎发育、根的形成以及种子和果实的发育等方面都起着重要的作用。此外研究发现,同一MADS box基因在发育的不同时期可以起不同的功能。 MADS box基因对生殖生长的调控是近年来MADS box基因作用研究的重点。为了研究李属（Prunus sp.）果树生殖调控的相关基因,对国际公共数据库中的李属植物的EST（Expressed sequence tags）序列进行了电子拼接,获得了8个MADS box基因的cDNA序列,并利用PCR技术从桃的果实中克隆出其中的4个cDNA,分别命名为PpMADS2、PpMADS4、PpMADS6和PpMADS7,其中PpMADS4和PpMADS6在GenBank中的登陆号分别为AY705972和AY705973。PpMADS4基因长850bp,包含一个732bp的开放阅读框,编码243个氨基酸。PpMADS6基因长1190bp,包含1个768bp的开放阅读框,编码256个氨基酸。 PpMADS4和PpMADS6在序列上分别与拟南芥中的AGAMOUS基因和矮牵牛中的PFG基因高度同源。RT-PCR分析表明,PpMADS4基因在花瓣、心皮、果实及核仁中表达,应属于已知的花器发育的调控的C类MADS box基因。PpMADS6基因在萼片、花瓣、心皮、果实及果仁中表达,应属于调控植物由营养生长向生殖生长

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写
• 第一章 引言
• 一、ABC模型研究进展
• 1、同源异型基因
• 2、同源异型基因和ABC模型
• 3、ABC模型的研究进展
• 二、植物MADS BOX基因研究进展
• 1、MADS box基因的起源、进化
• 2、MADS box基因的结构特性
• 3、植物MADS box基因的功能
• 4、植物MADS box基因的分类
• 5、植物MADS box基因的分布
• 6、植物MADS box基因参与植物花发育的调控
• 7、植物MADS box基因的生物学功能及其多效性
• 8、植物MADS box基因研究存在的问题与展望
• 三、本实验研究目的
• 第二章 材料与方法
• 一、实验材料
• 1、植物材料
• 2、菌株
• 3、质粒载体
• 4、酶、抗生素及各种试剂
• 5、培养基的配制
• 6、常用抗生素母液浓度
• 7、常用溶液
• 8、引物
• 9、实验中所用试剂盒
• 10、实验中所用程序及软件
• 二、实验方法
• 1、目的基因的克隆
• 1.1 桃的MADS box基因的同源基因EST片段筛选
• 1.2 TE3D法提取植物总RNA
• 1.3 cDNA的扩增
• 1.4 引物的设计
• 1.5 PCR扩增
• 1.6 连接反应
• 1.7 感受态细胞的制备
• 1.8 质粒DNA的转化
• 1.9 质粒DNA的提取
• 1.10 阳性克隆的PCR鉴定
• 1.11 琼脂糖凝胶电泳
• 1.12 目的片段的测序
• 2、基因的序列分析与表达分析
• 2.1 全长cDNA编码蛋白质序列分析
• 2.2 基因的表达分析
• 2.2.1 引物的设计
• 2.2.2 RT-PCR分析
• 3、载体的构建
• 3.1 pBI121与含目的基因的质粒的限制性内切酶消化
• 3.2 目的DNA片段的回收
• 3.3 pBI12的去磷酸化
• 3.4 载体与目的DNA片段的连接
• 4、农杆菌GV3101感受态细胞的制备及转化
• 4.1 农杆菌GV3101感受态细胞的制备
• 4.2 农杆菌GV3101感受态细胞转化
• 4.3 农杆菌阳性克隆的鉴定
• 5、农杆菌介导的拟南芥转化（浸渍法）
• 5.1 植物材料及处理
• 5.2 农杆菌的准备
• 5.3 转化
• 5.4 拟南芥阳性苗的筛选
• 6、DNA的提取与纯化
• 6.1 CTAB法提取植物基因组DNA
• 第三章 结果与分析
• 一、目的基因的克隆
• 1、李属主要EST数据的整合和MADS box同源物的筛选。
• 2、基因的克隆
• 二、基因的序列分析与表达分析
• 1、基固序列分析
• 2、PpMADS4和PpMADS6蛋白的同源性比对和蛋白结构分析
• 3、PpMADS4和PpMADS6蛋白的系统进化分析
• 4、PpMADS4与PpMADS6基因的RT-PCR分析
• 三、表达载体的构建与鉴定
• 四、农杆菌介导的拟南芥转化及鉴定（COLUMBIA生态型）
• 1、抗性株的筛选
• 2 转基因拟南芥的PCR鉴定
• 五、转基因拟南芥的表型观察
• 六、农杆菌介导的LANDSBERG生态型拟南芥转化
• 第四章 讨论
• 1、李属EST数据分析
• 2、PpMADS6蛋白的功能
• 3、PpMADS4蛋白的功能
• 4、进一步研究工作
• 参考文献
• 致谢
• 附录