哺乳动物细胞质膜及乳腺癌变蛋白质组研究

论文摘要

细胞质膜（PM）是细胞与环境直接接触的界面。镶嵌或连接于其中的蛋白质作为细胞的“门铃”与“门户”，是现有的70％的药物的靶标，因此细胞质膜蛋白质组的研究具有重要的理论与实际应用意义。然而，由于质膜蛋白质具有难溶、低丰度以及组成复杂等特点，是一项具有极大挑战性的研究。 首先，本文以鼠肝为材料，对质膜蛋白质组的研究进行了一系列的方法摸索。肝脏在人体的生命活动中具有非常重要的功能，是一个复杂性仅次于大脑的器官。分析其质膜蛋白质组将有助于对肝脏的认识和肝病的治疗。我们用蔗糖密度梯度离心法纯化质膜，优化出适合2DE分离膜蛋白的裂解液（含4％w／v CHAPS和1％NP-40等）和初步摸索出整合膜蛋白质的富集方法（氯仿和甲醇抽提，Na2CO3处理）。对用2DE和SDS-PAGE分离的蛋白质进行质谱鉴定，一共鉴定了175个非冗余蛋白质。其中9％的蛋白质功能未知，生物学分析发现四个未知蛋白质可能与肌肉营养不良等疾病有关。其次，为了鉴定低丰度、强疏水性整合质膜蛋白质，我们用Na2CO3处理，氯仿与甲醇抽提，以及质膜微区分离策略来富集这些蛋白质。通过2DE／1DE-MS／MS的技术路线分析，一共鉴定了457个非冗余蛋白质，其中23％的带有一个或一个以上跨膜区（TM）。在这457个蛋白质中，有53个与细胞通信相关。对这些鉴定的蛋白质进行emPAI分析，发现有50％的蛋白质的浓度低于0.1M，其中12％的蛋白质浓度比arginase 1和actin的低100倍。对鉴定蛋白质的理化性质分析，发现Na2CO3处理有利于碱性蛋白质研究，氯仿与甲醇有利于多跨膜区蛋白质研究，微区策略有利于低丰度蛋白质研究。再有，为了提高质膜的纯度，采用抗体磁珠免疫亲和纯化方法来纯化质膜。通过对4种富集方法的比较，找到了最佳的纯化方法。与密度梯度离心的结果相比，这种方法能将质膜的纯度提高3倍，线粒体的污染减少了2倍，内质网的污染几乎被去除。随后，我们优化了初质膜、磁珠以及抗体的用量，得到了适合蛋白质组研究的较少用量。对纯化的质膜蛋白质进行SDS-PAGE分析，质谱鉴定。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 质膜蛋白质组学研究进展
• 1.1 质膜及其微区的纯化和纯度判断
• 1.2 质膜蛋白质组的研究
• 1.3 结论及未来展望
• 第二章 鼠肝质膜蛋白质组研究
• 第一节 小鼠肝质膜蛋白质组初步研究
• 2.1.1 前言
• 2.1.2 材料与方法
• 2.1.3 结果
• 2.1.4 讨论
• 第二节 基于胶的低丰度、强疏水性膜蛋白质组研究
• 2.2.1 前言
• 2.2.2 材料与方法
• 2.2.3 结果
• 2.2.4 讨论
• 第三节 亲和分离纯化细胞膜
• 2.3.1 前言
• 2.3.2 材料与方法
• 2.3.3 结果
• 2.3.4 讨论
• 第三章 鼻咽癌细胞质膜蛋白质组研究
• 第一节 鼻咽癌细胞系HNE1细胞表面蛋白质组全息研究
• 3.1.1 前言
• 3.1.2 材料与方法
• 3.1.3 结果
• 3.1.4 讨论
• 第二节 不同分化程度鼻咽癌细胞系质膜蛋白质组研究
• 3.2.1 前言
• 3.2.2 材料与方法
• 3.2.3 结果
• 3.2.4 讨论
• 第四章 乳腺癌变蛋白质组研究
• 第一节 乳腺癌蛋白质组研究进展
• 4.1.1 样品处理
• 4.1.2 分离与鉴定技术路线
• 4.1.3 乳腺癌蛋白质组学研究进展
• 4.1.4 结语
• 第二节 激素诱导乳腺癌变蛋白质组研究
• 4.2.1 前言
• 4.2.2 材料与方法
• 4.2.3 结果
• 4.2.4 讨论
• 第五章 主要研究结果与进一步研究设想
• 5.1 主要研究结论
• 5.2 进一步研究设想
• 参考文献
• 缩写表
• 附表2.1.1
• 附表2.2.1
• 附表2.3.1
• 附表3.1.1
• 论文发表情况
• 致谢
• 原创性声明