超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）CTX-M-69基因的克隆表达、鉴定及酶学性质初步研究

论文摘要

本研究根据Genbank中CTX-M-1组超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的基因序列为目的基因,设计并合成了特异性引物,采用PCR技术,以产CTX-M型ESBLs菌株的质粒为模板,扩增出CTX-M型ESBLs全基因,将全基因序列克隆到PGM-T载体上并测序,测序结果表明其开放阅读框有876个碱基,编码291个氨基酸。将序列结果送交国际β-内酰胺酶认证机构（http://www.lahey.org/Studies）,证实本研究扩增的序列是一种新型的CTX-M型ESBLs基因,命名为CTX-M-69（GenBank登录号:EU402393）,蛋白质序列编号为ABY91281.1。将CTX-M-69核苷酸序列及推导氨基酸序列与国内外其它CTX-M型ESBLs进行同源性比较,结果显示,CTX-M-69序列与CTX-M-1（GenBank登录号:X92506）的核苷酸同源性为98%（867/877）,与CTX-M-1编码的氨基酸序列（GenBank登录号:CAA63262.1）同源性为98%（287/291）,确定CTX-M-69基因属于CTX-M-1组。与CTX-M-1相比,有10个核苷酸位点发生突变,其中6个位点为无义突变,4个位点发生了氨基酸替换。同时,与GenBank上同一组的部分CTX-M型氨基酸序列比较发现,同源性达到了98.9%以上。采用PCR技术,以CTX-M-69基因克隆载体为模板,扩增出蛋白的编码基因（876bp）,并将其插入pET-30b（+）表达质粒,构建了ESBLs CTX-M-69重组表达质粒。重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE结果表明表达出33kD左右的融合蛋白,可溶性检测表明表达产物以可溶性形式（上清中）和包涵体形式（沉淀中）两种形式存在。通过对表达条件的优化,试验确定ESBLsCTX-M-69蛋白表达的最佳条件为诱导物IPTG 0.4mmol/L,30℃诱导培养4h,在最佳表达条件下,重组蛋白表达含量有较明显的提高。CTX-M-69基因工程菌对头孢噻肟、头孢他啶、含克拉维酸的头孢噻肟和头胞他啶的药物敏感性试验,结果表明基因工程菌符合产超广谱β-内酰胺酶的表型特征（NCLLs2006）,表明CTX-M-69基因工程菌产ESBLs。同时,重组蛋白对12种β-内酰胺类水解活性的测定表明抗菌谱与CTX-M-1组大致相当,最大的区别在于CTX-M-69型ESBLs对头孢他啶的水解能力较弱。试验测定结果表明CTX-M-69型ESBLs在pH为7.8～8.6,温度为30℃时活性最大,底物浓度过大时酶的活性反而受到抑制。本实验利用PCR技术克隆出CTX-M型ESBLs全基因,首次发现了ESBLs新基因CTX-M-69,构建了ESBLs CTX-M-69基因的原核表达系统,实现了ESBLsCTX-M-69的高效表达,初步测定酶动力学特征,为进一步研究ESBLs CTX-M-69基因的结构、生物学活性及其蛋白质的空间构象提供了理论基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1.前言
• 1.1 β-内酰胺类药物及抗菌机理
• 1.2 细菌对β-内酰胺类药物的耐药机理及β-内酰胺酶的分类
• 1.3 超广谱β-内酰胺酶分类概述
• 1.4 CTX-M型超广谱β-内酰胺酶研究进展
• 1.4.1 CTX-M型ESBLs分子结构特性
• 1.4.2 CTX-M型ESBLs分子生物学特征
• 1.4.3 CTX-M型ESBLs的分类与分布
• 1.4.4 CTX-M型ESBLs的传播
• 1.5 本研究的前期工作基础
• 1.6 本研究的目的意义及创新点
• 1.7 技术路线
• 2.材料
• 2.1 菌株和载体
• 2.2 培养基
• 2.3 主要试剂
• 2.4 主要仪器
• 3.方法
• 3.1 CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因的PCR扩增、克隆与序列分析
• 3.1.1 CTX-M-1型全基因PCR扩增引物设计
• 3.1.2 菌株的培养
• 3.1.3 全基因PCR扩增
• 3.1.4 PCR扩增产物的回收
• 3.1.5 PCR产物与pGM-T载体的连接
• 3.1.6 连接产物转化E.coli DH5a
• 3.1.7 重组克隆质粒的鉴定
• 3.1.8 基因生物信息学分析
• 3.2 超广谱β-内酰胺酶CTX-M型基因的原核表达
• 3.2.1 pET-30b（+）/CTX-M重组表达质粒的构建
• 3.2.2 pET-30b（+）/CTX-M重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
• 3.2.3 重组菌的药敏测定
• 3.2.4 重组表达产物的可溶性检测
• 3.2.5 重组蛋白酶原核表达条件的优化
• 3.3 重组蛋白酶对β-内酰胺类抗生素的作用及动力学特征
• 3.3.1 β-内酰胺酶初提液的制备
• 3.3.2 确定各底物的最佳波长
• 3.3.3 酶对抗生素作用的测定
• max)的求取'>3.3.4 酶的米氏常数（Km）和最大反应速度(V_max)的求取
• 3.3.5 pH、温度、底物浓度对酶反应速度的影响
• 4.结果
• 4.1 CTX-M型ESBLs全基因的扩增、克隆与序列分析结果
• 4.1.1 全基因PCR产物电泳结果
• 4.1.2 重组克隆质粒的鉴定结果
• 4.1.3 基因生物信息学分析结果
• 4.2 CTX-M-69型ESBLs的原核表达结果
• 4.2.1 pET-30b（+）/CTX-M-69表达质粒的构建结果
• 4.2.2 重组菌的药敏实验结果
• 4.2.3 CTX-M-69型ESBLs重组蛋白的诱导表达和可溶性检测
• 4.2.4 CTX-M-69型ESBLs重组蛋白原核表达条件的优化结果
• 4.3 重组蛋白对β-内酰胺类抗生素的作用及动力学特征
• 4.3.1 酶对12种β-内酰胺类抗生素作用结果
• 4.3.2 酶的动力学特征
• 4.3.3 pH、温度、底物浓度对酶反应速度的影响
• 5.讨论
• 5.1 CTX-M-69基因的发现
• 5.2 CTX-M型ESBLs流行病学多样性
• 5.3 表达载体的选择
• 5.4 重组蛋白原核表达条件的优化
• 5.5 CTX-M-69野生菌和基因工程菌耐药表型变化比较
• 5.6 酶学性质
• 5.7 氨基酸残基的改变对酶活性的影响
• 6.结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录