多壁碳纳米管致细胞氧化应激效应及细胞适应性机理

论文摘要

目前,随着纳米材料在生物医学领域研究的日益拓展,纳米材料的负面生物效应即生物安全性问题逐渐成为纳米科技研究领域关注的热点之一。在细胞及分子水平进行的纳米物质生物效应及毒理学研究主要集中在不同纳米材料暴露下对细胞毒性、凋亡以及对细胞因子的影响等“损伤”状态下细胞毒理效应及其机制的研究。至于暴露于纳米材料后细胞“适应性”生物应激保护机制未见相关报道。血红素加氧酶-1作为细胞内重要抗氧化抵御酶,其诱导表达被认为是机体对各种氧化应激的一种适应性保护反应。作为纳米材料重要成员之一的碳纳米管,由于特殊的性质及易于制备、易于生物修饰等优点有望在生物医学领域得到广泛应用,但有关碳纳米管的生物效应还缺乏深入系统的研究。本文结合分子毒理学研究新进展,以人肺腺癌细胞株A549作为模型细胞,探讨了多壁碳纳米管致细胞氧化应激效应及细胞适应性反应机制,主要研究内容和取得的结果如下:（1）利用透射电子显微镜、扫描电子显微镜、热重分析仪和X射线光电子能谱等对三种不同规格的多壁碳纳米管（外径20～30 nm,长约30μm,MWCNT20;外径＜8 mm,长约30μm,MWCNT8;外径20-30 nm,长0.5-2μm,MWCNT20’）进行表征结果表明,三种规格的多壁碳纳米管管径较为均一,样品中催化剂杂质含量低,各样品纯度均大于98%。（2）利用MTT比色分析法探讨了A549细胞暴露于三种不同规格多壁碳纳米管的剂量、时间一毒性效应关系;利用透射电子显微镜观察了细胞暴露于三种不同规格的多壁碳纳米管中24 h、48 h、72 h时多壁碳纳米管在细胞内的分布情况结果发现,A549细胞暴露于200μg/mL的MWCNT20、MWCNT8和MWCNT20′24 h时细胞活性依次为87.12%±4.76%、85.92%±3.39%和67.50%±1.63%:当暴露时间延长至72 h时,200μg/mL MWCNT20、MWCNT8和MWCNT20’处理组A549细胞活性则依次下降到45.58%±3.41%、55.65%±3.58%和38.86%±4.12%。透射电镜观察结果表明,A549细胞暴露于多壁碳纳米管24 h时上述三种多壁碳纳米管均进入到了细胞内,其中MWCNT20’在细胞质和细胞核内均有分布,MWCNT20与MWCNT8仅定位于细胞质中。（3）以活性氧（reactive oxygen species,ROS）捕获剂2′,7′-二氢二氯荧光黄双乙酸钠为标记探针,利用流式细胞仪和激光共聚焦扫描显微镜检测A549细胞暴露于MWCNT20后细胞内的荧光强度,间接检测细胞内ROS的水平结果发现,A549细胞暴露于200μg/mL MWCNT20 1 h,细胞内ROS水平即明显提高。通过酶循环法检测胞内还原型谷胱甘肽GSH的含量发现,A549细胞暴露于200μg/mL的MWCNT20 6 h,细胞内GSH含量显著下降;暴露12 h时,与对照组相比A549细胞内GSH含量下降超过50%,提示多壁碳纳米管诱导A549细胞发生氧化应激。（4）探讨了A549细胞暴露于MWCNT20后细胞内血红素加氧酶（hemeoxygenase,HO）的酶活性变化和血红素加氧酶-1（HO-1）蛋白表达情况。酶活性检测结果表明,A549细胞暴露于MWCNT20后细胞内HO酶活性呈碳纳米管剂量依赖性升高,在给定剂量范围内MWCNT20剂量越大,HO酶活性越高;Western blot结果发现,HO-1蛋白表达呈暴露时间依赖性增多。应用HO-1竞争性抑制剂（锌原卟啉-9）和HO-1的催化产物（胆红素）,考察了HO-1表达对碳纳米管暴露后A549细胞的“适应性”保护作用。往培养基中添加锌原卟啉-9进一步降低了MWCNT20引起的细胞活性并导致ROS聚积增加,而添加50nmol/L的胆红素则逆转了锌原卟啉-9引起的上述反应。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 碳纳米管及其复合材料在生物医学工程领域的应用进展
• 1.3 纳米颗粒暴露与健康
• 1.4 纳米材料生物效应研究的必要性和紧迫性
• 1.5 碳纳米管生物效应及其毒理学研究现状与分析
• 1.6 纳米颗粒生物效应的可能机制
• 1.7 肺部抗氧化系统
• 1.8 本研究的提出和拟研究内容
• 第二章 多壁碳纳米管致细胞毒性作用研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.4 本章小结
• 第三章 HO-1诱导对MWCNT致细胞氧化应激的保护作用
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.4 本章小结
• 第四章 全文主要结论
• 参考文献
• 硕士期间发表与交流的论文
• 致谢