间接ELISA检测HPS抗体方法的改进与四川部分地区HPS的血清学调查

论文摘要

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis, HPS）是猪上呼吸道的一种常在菌,在一定条件下可侵入机体从而引起严重的全身性疾病,以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征。副猪嗜血杆菌病呈世界性分布,已成为危害全球养猪业的主要细菌性疾病之一。本研究进行了间接ELISA检测HPS抗体方法的改进与四川部分地区HPS的血清学调查。一、副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA方法的改进本研究在已建立的HPS抗体间接ELISA检测方法的基础上加以改进优化,以适应生产上该方法进行血清学检测和调查的需要。首先,试验进行了猪抗HPS阳性血清的制备。以HPS血清5型菌培养灭活后制备成抗原,抗原量为1×109CFU/ml,对检测HPS抗体阴性的猪进行肌肉注射,间隔2周一次,每次注射2m1,共免疫注射3次；最后1次灭活抗原免疫后1周,以HPS血清5型活菌耳静脉注射2m1（1×109CFU/m1）,最后分离血清进行IHA试验检测,其猪抗HPS阳性血清检测效价为1：1024。试验成功制备了猪抗HPS阳性血清,该血清可作为ELISA方法的标准阳性对照血清。其次,对间接ELISA检测猪HPS血清抗体方法进行了改进和优化。采用方阵滴定法确定HPS超声波破碎抗原的最佳包被浓度为1：100（30μg／m1）；血清最佳稀释倍数为1：160。通过梯度筛选确定兔抗猪IgG-HRP酶标二抗工作浓度为1：5000。最后,对改进的该方法进行了敏感性、特异性和与IHA检测方法的比较研究,结果表明：该改进方法的敏感性明显高于IHA试剂盒,是IHA试剂盒的2.5倍至10倍;以间接ELISA对猪APP、E.coli、SS、PM、JEV等阳性血清检测均为阴性,表明具有良好的特异性；该改进方法和IHA方法比较,对86份待检血清进行检测,间接ELISA检测方法检出HPS抗体阳性的血清有10份,阳性检出率为11.6%（10／86）；IHA检测方法检出HPS抗体阳性的血清有8份,阳性检出率为9.3%（8／86）,表明改进的间接ELISA方法检测猪血清样本与IHA方法的符合率较高,且HPS抗体的阳性检出率较高。二、四川部分地区HPS血清学调查本研究对副猪嗜血杆菌在四川省部分地区的流行情况进行了血清学调查,应用改进后的间接ELISA方法对近2年采集和收集自四川省15个地区的632份猪血清样品进行检测。结果显示,632份血清中103份为HPS抗体阳性,阳性检出率在0%-66.6%之间,总检出阳性率16.3%（103/632）；对不同生长阶段猪群进行检测结果为,保育猪阳性率28.2%（29/103）,育肥猪阳性率为19.4%（57/294）,成年种猪阳性率为6.8%（16/235）。血清学调查结果表明：调查的四川大部分地区猪群中副猪嗜血杆菌感染的情况普遍存在,其中凉山、达州、乐山、峨眉山、资阳等地区的HPS血清抗体检出阳性率较高,分别是66.6%,34.6%,30.2%,17.1%,16.3%；保育猪的HPS感染率明显高于其他生长阶段猪感染率。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 副猪嗜血杆菌病的病原学
• 1.1 血清型分型
• 1.2 基因型分型
• 2 副猪嗜血杆菌的毒力因子
• 2.1 荚膜
• 2.2 外膜蛋白
• 2.3 菌毛
• 2.4 脂多糖和脂寡糖
• 2.5 转铁结合蛋白
• 2.6 酶类及其他
• 3 副猪嗜血杆菌病的流行病学
• 4 副猪嗜血杆菌病的临床症状
• 5 副猪嗜血杆菌病的诊断
• 5.1 病原学诊断
• 5.2 血清学诊断
• 6 副猪嗜血杆菌病的免疫预防
• 研究目的和意义
• 第二章 副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的改进
• 1 材料
• 1.1 菌种和其他试剂
• 1.2 培养基
• 1.3 ELISA相关试剂和溶液
• 1.4 主要仪器
• 1.5 试剂盒
• 1.6 实验动物
• 2 方法
• 2.1 猪HPS阴阳性血清的制备
• 2.2 ELISA抗原的制备
• 2.3 间接ELISA方法
• 2.4 IHA试剂盒方法
• 3 结果
• 3.1 不同时期的血清效价测定
• 3.2 超声波破碎抗原的浓度测定
• 3.3 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定
• 3.4 酶标二抗最佳稀释度的确定
• 3.5 间接ELISA结果判定标准
• 3.6 特异性试验
• 3.7 敏感性试验
• 3.8 符合率试验
• 4 讨论
• 4.1 阳性血清的制备
• 4.2 对间接ELISA方法的改进
• 5 结论
• 第三章 四川部分地区副猪嗜血杆菌病的血清学调查
• 1 材料
• 1.1 血清样品
• 1.2 试剂
• 2 方法
• 2.1 超声波破碎抗原的制备
• 2.2 间接ELISA操作步骤
• 3 结果
• 3.1 不同种类副猪嗜血杆菌感染情况
• 3.2 不同地区副猪嗜血杆菌感染情况
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录