苎麻GalAT、UGlcAE基因克隆及组织表达研究

论文摘要

苎麻韧皮纤维是一种具有中国特色的优良植物纺织材料,然而脱胶过程出现了许多问题和不足:如降低麻纤维强度、精干麻制成率较低、纤维可纺性能劣化、工艺流程长、脱胶成本高、煮炼废液含碱较多、环境污染严重、能源消耗大等,严重制约了麻纺工业的发展。果胶是苎麻韧皮部主要的胶质成分之一,在胶质成分中仅次于半纤维素,它将各种胶质组分粘在一起使得其它胶类物质难以脱除,去除果胶是苎麻脱胶的主要目标之一。适度降低果胶的含量是当前苎麻品质育种的一个重要方向。GalAT（α-1,4-Galacturonosyltransferase）和UGlcAE（UDP-glucuronic acid 4-epimerase）分别是果胶及果胶主要组分生物合成的关键酶。因而对GalAT和UGlcAE的基因序列及组织表达特征进行研究,为后期从分子水平上调控苎麻果胶含量的研究奠定基础具有较大的实际价值。本研究采用SMART技术构建苎麻韧皮部全长cDNA文库;用简并引物RT-PCR法克隆目标基因cDNA核心序列;用RACE技术和全长cDNA文库筛选法获得全长cDNA序列;用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析;用荧光实时定量PCR法对目标基因在不同组织中的表达进行研究。主要研究结果如下:（1）构建了苎麻优良品种:中苎一号的韧皮部全长cDNA文库,原始文库滴度为1.25×105pfu/mL,重组率为92%,扩增文库滴度为1.13x109pfu/mL。为克隆苎麻优良基因全长序列,并研究其遗传规律打下了基础。（2）克隆了GalAT基因的三个cDNA片段,序列长度分别为1087bp、986bp和238bp。将986bp序列登录Genbank,获得登录号为:EU131377。该序列编码328个连续氨基酸序列,用NCBI进行在线保守区分析,结果表明包含一个保守区:Glycosyl-transferase family 8;BlastN分析发现与拟南芥的GAUT4（拟南芥Galacturonosyltransferase家族基因之一）的同源性最高,为77%;BlastP分析发现与拟南芥的GAUT4同源性最高,为83%;多序列比对分析表明苎麻GalAT基因与拟南芥Galacturonosyltransferase基因家族的基因有一定程度的保守性;分子进化分析表明:苎麻GalAT基因的推定蛋白氨基酸序列与拟南芥的GAUT4聚为一类,它们之间的同源关系明显大于拟南芥Galacturonosyltransferase家族其它基因。（3）克隆了UGlcAE基因的三个cDNA片段,序列长度分别为308bp、410bp和262bp。（4）以已获得的UGlcAE基因的410bp cDNA片段为基础克隆了它的全长cDNA序列,序列长度为1257bp,开放读码框介于443bp和1165之间,编码241个的氨基酸序列,Genbank登录号为EU131378。经预测蛋白质的等电点pI为9.86,相对分子质量为26kD,InterPro分析发现存在NAD（P）结合位点、NAD-dependent epimerase/dehydratase和UDP-galactose-4-epimerase结构域,用NCBI编码区序列进行在线保守区分析,结果表明含有高保守区UDP-galactose-4-epimerase。Blastn分析发现与与玉米的同源性最高,为84%,BlastP分析发现与拟南芥的GAE6（拟南芥UGlcAE家族基因之一）同源性最高。多序列比对分析表明,苎麻UGlcAE基因推定氨基酸序列与其它物种相应序列存在较高的的保守性,分子进化分析发现苎麻的UGlcAE基因推定的氨基酸序列与拟南芥UGlcAE家庭基因GAE6的同源性高于其它植物以及拟南芥的其它UGlcAE家族基因。（5）研究了GalAT基因在苎麻中苎一号中各组织的表达分布情况,通过实时荧光定量PCR证实,GalAT基因在苎麻各个组织中都有表达,其中根部的GalAT基因表达量占优,叶片次之,韧皮部和木质部含量最少,并且两者无显著差别。（6）研究了UGlcAE基因在苎麻中苎一号中各组织的表达分布情况,通过实时荧光定量PCR证实,UGlcAE基因在苎麻各个组织中都有表达,UGlcAE基因的mRNA量依次为根部〉叶片〉韧皮部〉木质部。（7）比较了GalAT和UGlcAE基因在苎麻各组织表达情况的差异,两基因在各组织中的表达情况基本一致,都表现为根部〉叶片〉韧皮部〉或≈木质部,在本研究感兴趣的韧皮部中,GalAT基因的表达量是UGlcAE基因的0.6533倍,提出在后期进行苎麻果胶分子调控试验可优先从GalAT基因入手或同时进行双基因共抑制。综上所述,本研究在分离和克隆苎麻果胶合成相关酶GalAT、UGlcAE基因及其组织表达特征研究方面取得了一定进展,为后期从分子水平上调控苎麻果胶含量,获得低果胶含量的优良苎麻转基因新品种奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 第一节 果胶及果胶合成相关酶的研究概况
• 1.1 果胶在苎麻脱胶过程中的负面影响
• 1.2 果胶的研究现状
• 1.2.1 果胶的结构
• 1.2.2 果胶的生物功能
• 1.2.3 果胶的生物合成
• 1.2.4 GalAT（α-1,4-Galacturonosyltransferase）的研究现状
• 1.2.5 UGlcAE（UDP-glucuronic acid-4-epimerase）的研究现状
• 第二节 CDNA 文库技术简介
• 2.1 cDNA 文库构建的基本原理与方法
• 2.2 全长cDNA 文库构建
• 2.3 SMART 方法原理
• 2.4 cDNA 文库质量的评价分析
• 2.5 全长cDNA 克隆的筛选和识别
• 2.6 从cDNA 文库分离新基因的方法
• 第三节 REAL-TIME PCR 简介
• 3.1 PCR 过程分析
• 3.2 实时定量 PCR 中的术语
• 3.3 荧光化学
• 3.4 定量方法
• 第四节 本研究的目的与意义
• 第二章 苎麻韧皮部全长 CDNA 文库的构建
• 第一节 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 方法
• 第二节 结果与分析
• 2.1 总 RNA 的提取
• 2.2 双链cDNA 的合成
• 2.3 cDNA 的蛋白酶 K 降解、Sfi I 酶切及分级分离
• 2.4 文库滴度与重组率测定
• 2.5 插入片段大小检测
• 第三节 讨论
• 第三章 苎麻果胶合成相关酶 GALAT、UGLCAE 基因的克隆与分析..
• 第一节 苎麻果胶合成相关酶 GALAT 基因的克隆与分析
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 材料与试剂
• 1.1.2 方法
• 1.2 结果与分析
• 1.2.1 GalAT 基因核心序列的克隆
• 1.2.2 GalAT 基因的生物信息学分析
• 第二节 苎麻果胶合成相关酶 UGLCAE 基因的克隆与分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 UGlcAE 基因核心片段的克隆
• 2.2.2 UGlcAE 基因全长序列的克隆
• 2.2.3 UGlcAE 基因的生物信息学分析
• 第三节 讨论
• 3.1 提取的总 RNA 质量是克隆目的基因的关键所在
• 3.2 简并引物的设计及反应条件的优化
• 3.3 分子进化分析
• 3.4 GalAT 基因及 UGlcAE 基因可能存在的基因家族分析
• 第四章 苎麻果胶合成相关酶 GALAT、UGLCAE 基因的组织表达分析
• 第一节 苎麻果胶合成相关酶 GALAT 基因的组织表达分析
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 方法
• 1.2 结果与分析
• 1.2.1 Actin 基因作为内参的可行性分析及研究
• 1.2.2 内参照 Actin 基因的实时扩增
• 1.2.3 GalAT 基因的实时扩增
• 1.2.4 试验结果的校正
• 第二节 苎麻果胶合成相关酶UGLCAE 基因的组织表达分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 内参照 Actin 基因的实时扩增
• 2.2.2 UGlcAE 基因的扩增
• 2.2.3 试验结果的校正
• 2.2.4 GalAT 基因与 UGlcAE 基因组织表达差异的分析
• 第三节 讨论
• 3.1 荧光实时定量 PCR 使用探讨
• 3.2 GalAT 基因组织表达分析的意义及结果
• 3.3 UGlcAE 基因组织表达分析的意义及结果
• 3.4 GalAT 基因和 UGlcAE 基因组织表达量的比较
• 第五章 结论
• 1 主要研究结果
• 2 主要创新点
• 3 今后研究的方向与目标
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简 历