4-HPR联合应用小白菊内酯对肝癌细胞凋亡的作用及分子机制研究

论文摘要

细胞凋亡（apoptosis）,又称程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）,是由于细胞内外环境变化或死亡信号触发以及在基因调控下所引起的细胞主动死亡的过程。目前已证实多种基因参与了细胞凋亡的调控。研究表明,无论是体外的组织细胞培养还是体内动物实验,细胞凋亡存在于肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）的发生、发展过程中。现在肝癌的许多非手术性治疗方法,如经导管肝动脉栓塞化疗术（TACE）、经皮穿刺瘤内酒精注射术（PEI）、射频、微波固化（PMCT）、冷冻等都与肝癌细胞凋亡密切相关。因此,通过诱导促凋亡基因表达,可达到治疗目的。4-羟基维胺酯（N-4-hydroxyphenyl retinoid,4-HPR）是一种类视黄醇的合成化合物,能抑制肿瘤的发展,促进肿瘤细胞凋亡,但其诱导细胞凋亡的机制,尚不清楚。NF-κB是一种重要的核转录激活因子,与肿瘤细胞的耐药性和抗凋亡作用密切相关。芳香植物小白菊（Tanacetumparthenium）以及它的主要生物活性成分一小白菊内酯（Parthenolide）,具有抗菌和抗炎作用,并可抑制NF-κB的激活。尽管上述两种药物作用机理方面的研究已涉及到肿瘤细胞分化,信号转导以及逆转耐药等方面,但是4-HPR联合应用小白菊内酯对人肝癌细胞凋亡的作用及其分子机制尚未见报道。本实验的目的是研究小白菊内酯对4-HPR诱导肿瘤细胞凋亡的影响,检测4-HPR诱导肝癌细胞凋亡中的差异表达基因,筛选小白菊内酯引起的细胞凋亡相关基因候选者并探索其作用途径,为今后肝癌的药物治疗提供依据。本实验利用TUNEL法及流式细胞仪技术,采用Hep3B和SK-HEP-1两种肝癌细胞株,观察小白菊内酯联合应用4-HPR对肝癌细胞凋亡的作用,并利用凝胶电泳迁移率变化分析（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）、抗体胶移位分析（supershift assay）和放射自显影技术检测NF-κB、NF-κB p65、NF-κB p50、c-Rel、p52及RelB结合蛋白的表达;利用DD—PCR技术检测4-HPR处理和未处理的Hep3B差异表达基因,进一步确认和筛选凋亡相关基因候选者,并对筛选的cDNA进行克隆,测定基因序列后利用基因库中的BLAST程序确认;利用半定量反转录酶聚合酶链反应（RT-PCR）和Northern blotting技术,观察4-HPR联合应用小白菊内酯引起人肝癌细胞凋亡过程中差异表达基因,并进行分析。5’-末端快速扩增法（rapid amplification of cDNA ends,RACE）制备上调基因ANKRD1,并克隆到pEGM-T载体,进行鉴定:利用PCR技术扩增ANKRD1基因的正（sense）反（antisense）方向基因,并通过基因重组技术连接到增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因融合表达载体pEGFPC3和pcDNA3.1/HisA载体。再采用脂质体转染法,将重组基因转入Hep3B和SK-HEP-1两种肝癌细胞株,同时在荧光显微镜下观察GFP的表达,对转染后的肝癌细胞用G418（表达载体带有neo基因片断,对G418具有抗药性）筛选阳性克隆并分析克隆集落形成。在荧光显微镜下标记发光良好的单个克隆,分离克隆继续扩增培养建立稳定表达ANKRD1基因的细胞系,同时利用Western blotting技术和免疫细胞化学染色方法检测目的基因蛋白的表达。在激光共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscopy,LSCM）下,采用免疫荧光细胞染色法对Hep3B、SK-HEP-1、HepG2和Huh7肝癌细胞进行ANKRD1基因编码蛋白的定位和表达,并观察该基因高表达和低表达时细胞核形态学变化,并利用流式细胞仪检测高表达ANKRD1基因的细胞凋亡率。本研究的主要实验方法与结果:1.TUNEL法及流式细胞仪检测凋亡率:Hep3B和SK-HEP-1两种肝癌细胞株,分别给予4-HPR（10uM/ml）和4-HPR（10uM/ml）联合应用小白菊内酯（4uM/ml）,72个小时后通过TUNEL染色检测凋亡发生率,可见其凋亡率随着药物的不同升高,4-HPR联合应用小白菊内酯的细胞凋亡率近2倍高于单用4-HPR组,P＜0.01。通过流式细胞仪可观察小白菊内酯增强4-HPR诱导的肿瘤细胞凋亡,M1期细胞凋亡率明显高于对照组和4-HPR组,P＜0.01,但不影响细胞周期阻滞。2.利用EMSA方法检测药物处理后不同时间NF-κB的表达:4-HPR处理Hep3B和SK-HEP-1细胞0.2,0.5,1,3,6,12及24h后测定NF-κB表达,结果NF-κB随4-HPR作用时间延长增高。12h时NF-κB的活性最强。利用NF-κB家族特定抗体进行Supershift assay结果显示以NF-κB p65在4-HPR处理的Hep 3B细胞中高表达,之后观察4-HPR（10uM/ml）联合应用小白菊内酯（4uM/ml）对不同时间Hep3B肝癌细胞NF-κB的影响,结果小白菊内酯有效地阻断了4-HPR诱导的NF-κB活性,且12h时最明显。3.利用DD-PCR法检测4-HPR诱导细胞凋亡过程中基因表达:提取4-HPR处理和4-HPR未处理的Hep3B细胞总RNA,利用DD-PCR技术对大约13000个不同cDNA片断进行对照分析,并筛选93个差异表达的cDNA,并克隆到TA载体,测定基因序列后利用基因库中的BLAST程序确认。4.利用Northern blotting和RT-PCR进一步检测小白菊内酯调控的凋亡相关基因:对DD-PCR检测出的差异表达基因,通过Northern blot和RT-PCR技术进一步检测4-HPR联合应用小白菊内酯时差异表达基因,结果筛选了35个差异表达基因,由小白菊内酯上调18个基因（SNTB1,ALB,PSMD2,RPS23,DNMT,GADD153,SERPIND1,ARPP-19,ND2,ANKRD1和2个未知基因与对照组相比高表达1.5倍）和17个下调基因（Gas5,TF,ND3,CYR61,KTN1和5个未知基因与对照组相比低表达50%）,其中GADD153,NACA,TF和CYR61已证明与NF-κB活性有关。5.克隆基因及确定基因:35个凋亡相关基因,其中一个上调基因HA1A2从肝cDNA中分离克隆测序,结果与Gene Bank中ANKRD1一致,此基因在心肌也称为是CARP基因。6.构建ANKRD1正（sense,S）反（antisense,AS）方向真核表达载体及在Hep3B和SK-HEP-1细胞内表达:成功克隆了ANKRD1全长基因,并利用PCR技术分别扩增ANKRD1 sense和antisense基因片断,与pEGFPC3和pcDNA3.1/HisA真核表达载体进行重组,成功构建了ANKRD1真核表达载体,且在Hep3B和SK-HEP-1细胞内获得表达,并通过Western blotting和荧光显微镜进行了验证。7.细胞集落形成:将已构建的真核表达载体转染到Hep3B和SK-HEP-1细胞,用G418筛选阳性克隆时,观察到转染ANKRD1（S）的细胞克隆集落形成的细胞融合灶与pEGFPC3和pcDNA3.1/HisA空载体和ANKRD1（AS）相比减少约50%。8.ANKRD1蛋白的定位及细胞形态改变:将末端标记有绿色荧光蛋白（GFP）的ANKRD1瞬间转染到Hep3B（S）,Hep3B（AS）和SK-HEP-1,HepG2,Huh7细胞并利用鼠的抗ANKRD1的单克隆抗体进行免疫组织化学实验显示,GFP融合ANKRD1蛋白主要在胞浆内表达,在细胞核内很少表达;高表达细胞核膜浓缩、碎片状,引起细胞凋亡;瞬时转染pEGFPC3-ANKRD1基因的Hep3B细胞通过流式细胞仪分析细胞凋亡结果显示,空载体pEGFPC3转染细胞与对照组细胞的凋亡率相比未发生明显改变,但转染pEGFPC3-ANKRD1细胞凋亡率与空载体pEGFPC3转染细胞与对照组细胞相比有明显增高,增高至27.5±2.5%。以上结果提示:1.单独应用小白菊内酯不引起肝癌细胞凋亡,但与4-HPR联合应用可增强肝癌细胞凋亡,并且与细胞周期阻滞无关。2.小白菊内酯增强4-HPR诱导的肝癌细胞凋亡作用与抑制NF-κB活性有关。3.增加药物引起的细胞凋亡过程中,筛选出肝癌凋亡相关基因35个,其中一个上调基因HA1A2从肝cDNA中分离克隆并证明与ANKRD1一致。4.成功克隆ANKRD1基因,并构建了ANKRD1真核表达载体及在Hep3B和SK-HEP-1细胞内获得表达,为今后ANKRD1与肿瘤细胞凋亡的进一步研究打下了基础。5.ANKRD1具有引起肝癌细胞凋亡的潜能,有望成为肝癌治疗的分子作用靶点。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一章 前言
• 第二章 4-HPR联合应用小白菊内酯对肝癌细胞凋亡的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 细胞培养及传代
• 2.1.2.2 TUNEL染色检测细胞凋亡
• 2.1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡
• 2.1.2.4 核蛋白提取及电泳迁移率变动分析
• 2.1.2.5 抗体胶移位实验（Supershift Assay）
• 2.1.3 统计学分析
• 2.2 结果
• 第三章 小白菊内酯增加4-HPR诱导肝癌细胞凋亡相关基因的筛选
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 差异显示PCR
• 3.1.2.2 mRNA提取、纯化和Northern杂交
• 3.1.2.3 半定量RT-PCR测定分析
• 3.1.2.4 总蛋白提取、Western分析
• 3.1.3 统计学分析
• 3.2 结果
• 第四章 细胞凋亡关键基因ANKRD1的功能研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 cDNA末端快速扩增法（RACE）克隆ANKRD1基因片段
• 4.1.2.2 绿色荧光蛋白融合表达ANKRD1基因的载体构建及转
• 4.1.2.3 克隆（集落）形成实验
• 4.1.2.4 免疫细胞组织化学染色
• 4.1.2.5 流式细胞仪检测ANKRD1高表达细胞凋亡
• 4.1.2.6 小白菊内酯和4-HPR对稳定转染ANKRD1细胞系的细胞凋亡检测
• 4.1.3 统计学分析
• 4.2 结果
• 附图
• 第五章 讨论
• 5.1 肝癌凋亡相关基因的筛选
• 5.2 ANKRD1在肝癌形成中的作用
• 第六章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 附录A