恩施州川续断遗传多样性及道地性研究

论文摘要

川续断（Dipsacus asper Wall.）为川续断科植物,多年生草本。其干燥根是传统的中药材。分布在湖北五峰和湖北鹤峰的川续断由于其品质优良而得名“五鹤续断”,为恩施州道地药材之一。本研究以恩施州八个不同产地（建始龙坪、利川元堡、恩施鱼塘坝上坝、恩施鱼塘坝硒矿区、巴东绿葱坡、恩施双河、鹤峰太平、鹤峰五里坪）的川续断为材料,从形态性状、光合特性、同工酶酶谱及DNA水平对其进行了遗传多样性研究,以期为川续断的品质鉴定、道地性评价及保护与利用奠定理论基础。主要研究结果如下:1.形态特征分析分析川续断的根粗、根长、侧根数、茎长、茎棱数、茎粗、叶子长宽比以及种子千粒重这八个性状特征,根粗、根长、侧根数和种子千粒重达到了差异显著水平（P<0.05）,其中种子千粒重达到了差异极显著（P<0.01）水平。综合质量性状和数量性状进行聚类分析,将八份材料划分为三类,其中建始龙坪、利川元堡的为一类;恩施鱼塘坝上坝、恩施鱼塘坝硒矿区、恩施双河、巴东绿葱坡的为一类;鹤峰太平和鹤峰五里坪的为一类。2.光合特性分析用光谱吸收法测量新鲜叶片中的叶绿素含量,产地为恩施鱼塘坝硒矿区的川续断叶绿素a、叶绿素b含量最高,鹤峰五里坪和鹤峰太平的次之。川续断的净光合速率、暗呼吸率等光合日变化呈明显的单峰曲线,光合产物主要集中在上午积累;八个产地川续断的光饱和点在291.67～689.71μmol/m2s之间,其中鹤峰太平的光饱和点最高,达到了689.71μmol/m2s;光补偿点在20.88～72.52μmol/m2s之间,鹤峰五里坪的光补偿点最低,为20.88μmol/m2s。八个产地川续断的光饱和点和光补偿点都较低,说明其适合在半阴半阳的环境下栽培。综合以上数据,可以发现“五鹤续断”的道地产地之一的鹤峰五里坪、鹤峰太平以及恩施鱼塘坝高硒区的川续断在光合能力上强于其他五个产地。3.过氧化物酶同工酶谱分析同工酶研究中,分离胶浓度是影响其谱带效果的因素之一,本研究中,采用9.0%的分离胶浓度时川续断过氧化物酶同工酶电泳谱带效果最好;八个产地川续断的过氧化物酶同工酶共有5条谱带,Rf值在0.35～0.55之间,其中建始龙坪和恩施鱼塘坝上坝的谱带最多,有4条;而巴东绿葱坡的仅有一条谱带。根据酶谱的差异,将八份川续断材料可分为了两类。第Ⅰ类包括建始龙坪、恩施鱼塘坝上坝、恩施鱼塘坝硒矿区、鹤峰太平;其余的为第Ⅱ类,包括利川元堡、巴东绿葱坡、恩施双河、鹤峰五里坪。4.分子标记研究实验得到川续断RAPD反应体系的最佳条件为:在20μL的反应体系中,以50ng/μl的模板DNA浓度、1.0μmol/L的引物浓度、2.5 mmol/L的Mg2+浓度、39℃的退火温度为最佳。反应程序为94℃5min→（94℃30s→39℃40s→72℃2min）43个循环→72℃10min→4℃保持。采用最佳条件从50个随机引物中筛选出了5个多态性好的引物,进行聚类分析,将八份川续断材料分成了四类。第Ⅰ类包括建始龙坪、利川元堡;第Ⅱ类,包括恩施鱼塘坝上坝、恩施鱼塘坝硒矿区、巴东绿葱坡;第Ⅲ类包括鹤峰太平和鹤峰县五里坪;恩施双河独立分为一类。5.综合分析探讨恩施州川续断的遗传多样性,八份材料在小叶形状等形态性状、光饱和点等光合参数、过氧化物同工酶特性及分子水平上存在一定的差异,综合分析得到的分类结果基本一致,说明将这些研究方法结合起来综合评价是可行的。综合研究结果,可将八份材料分为两大类或者五小类,两大类:第Ⅰ类包括建始龙坪、恩施鱼塘坝上坝、恩施鱼塘坝硒矿区、鹤峰太平;其余的为第Ⅱ类,包括利川元堡、巴东绿葱坡、恩施双河、鹤峰五里坪;五小类:建始龙坪和利川元堡;恩施鱼塘坝上坝和鱼塘坝硒矿区;鹤峰太平和鹤峰五里坪;巴东绿葱坡以及恩施双河各成一类。根据实验结果进行道地性评价,如果从聚类分析来看,地理位置越近的材料,其亲缘关系越近,之间的差异也就越小。材料间的根粗、根长、侧根数和种子千粒重这些川续断的表观性状以及过氧化物同工酶酶谱的差异较显著,建议作为药材续断道地性评价的主要参数;鹤峰太平及鹤峰五里坪的川续断在净光合速率、水分利用率这些光合能力上强于其他地区,这与其“道地产地”的称谓相一致;因为药材的品质与特殊的产地环境有关,所以不同的生境是影响川续断不同性状的主要原因之一。另外,研究结果表明恩施鱼塘坝硒矿区川续断的叶绿素a、b含量以及光合能力仅次于鹤峰太平及五里坪,可能是由于硒元素能促进植物吸收与叶绿素合成有关的元素。在对其他植物的研究过程中,是否将硒元素含量作为一个参数进行探讨,尚待进一步思考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 川续断
• 1.1.1 药用历史及道地性
• 1.1.2 国内外研究现状及发展趋势
• 1.2 植物遗传多样性及道地性评价方法
• 1.2.1 药材遗传多样性研究方法
• 1.2.2 药材道地性评价方法
• 1.3 本论文研究内容、创新性及研究意义
• 1.3.1 研究内容
• 1.3.2 本论文的创新性及意义
• 第2章 川续断形态性状的研究
• 2.1 研究材料
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 质量性状特征分析
• 2.2.2 数量性状特征分析
• 2.2.3 聚类分析
• 2.3 研究结果
• 2.3.1 叶面性状差异分析
• 2.3.2 形态分化的方差分析
• 2.3.3 遗传多样性的聚类分析
• 2.4 结论与讨论
• 第3章 川续断的光合特性研究
• 3.1 材料及仪器
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验试剂与仪器
• 3.2 研究方法
• 3.2.1 叶绿素含量的测定
• 3.2.2 光合作用日变化测定
• 3.2.3 光合—光响应曲线测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 叶绿素含量的比较
• 3.3.2 光合作用日变化比较
• 3.3.3 净光合速率对光的响应比较
• 3.4 结论与讨论
• 第4章 川续断过氧化物酶同工酶研究
• 4.1 材料及仪器
• 4.2 研究方法
• 4.2.1 样品处理
• 4.2.2 同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 4.2.3 凝胶染色
• 4.2.4 结果计算
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 分离胶浓度的选择
• 4.3.2 过氧化物酶酶谱分析
• 4.3.3 遗传距离及聚类分析
• 4.4 结果与讨论
• 第5章 川续断分子标记研究
• 5.1 仪器和试剂
• 5.2 研究方法
• 5.2.1 基因组DNA 的提取
• 5.2.2 基因组DNA 纯度及浓度确定
• 5.2.3 基因组DNA 电泳
• 5.2.4 RAPD 反应体系的优化
• 5.2.5 RAPD 扩增
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 基因组DNA 纯度及浓度的测定
• 5.3.2 RAPD 反应体系的优化
• 5.4 RAPD 结果分析
• 5.4.1 带型识别和多态性分析
• 5.4.2 产地间相似系数的分析
• 5.4.3 个体水平的聚类分析
• 5.5 结论与讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间所发表的学术论文
• 致谢