牛源金黄色葡萄球菌免疫胶体金试纸条的研制

论文摘要

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎、子宫内膜炎等疾病的重要致病菌,因此,快速诊断牛源金黄色葡萄球菌具有重要的应用价值和理论意义。本研究应用PCR方法扩增出金黄色葡萄球菌A蛋白（spa）功能区基因片段,克隆测序后,与E.coli表达载体PQE-30连接,转入E.coli表达菌株BL21（DE3）,筛选得到可诱导表达spa蛋白的工程菌株,经IPTG诱导,分离纯化spa重组蛋白,建立间接ELISA方法,检测重组蛋白与抗体IgG结合情况。此外,应用纯化的金黄色葡萄球菌凝集因子A重组蛋白和全菌体疫苗分别免疫小鼠。应用间接ELISA方法和凝集试验分别检测小鼠血清中IgG抗体水平,当效价达到要求后,提取相应的抗体。用胶体金标记鼠抗金黄色葡萄球菌凝集因子A（clfA）重组蛋白特异性抗体,利用抗金黄色葡萄球菌抗体包被硝酸纤维素膜检测线,重组金黄色葡萄球菌A蛋白包被硝酸纤维素膜的质控线,组装免疫胶体金试纸条。结果表明:在金黄色葡萄球菌分离株中扩增出了spa基因,重组克隆PGEM-spa经测序后,与GenBank上S. aureus株的核苷酸及氨基酸序列一致性分别为98%和99.1%。SDS-PAGE结果表明,重组质粒PQE-30-spa在E. coli XL1-Blue中成功表达。二疫三周后,蛋白组及全菌体组小鼠血清效价达到最高值分别为1:160000、1:1000。免疫胶体金试纸条可以在10 min内完成对含金黄色葡萄球菌样品的检测;敏感度为3×104 cfu/mL;与大肠杆菌、链球菌、李氏杆菌、巴氏杆菌及蜡样芽孢杆菌无交叉反应;稳定性和重复性较好。综上所述,该试纸条检测金黄色葡萄球菌黑龙江株具有特异性好,灵敏度较高的特点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 金黄色葡萄球菌致病因子的研究进展
• 1.3 金黄色葡萄球菌检测方法的研究进展
• 1.4 免疫胶体金技术
• 1.5 目的和意义
• 1.6 创新点
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 第三章 结果
• 3.1 S.aureus spa 基因的PCR 扩增结果
• 3.2 S.aureus spa 基因的T-A 克隆及序列测定结果
• 3.3 spa 基因重组表达载体构建结果
• 3.5 血清IgG 水平变化
• 3.6 多克隆抗体的纯化及浓度测定
• 第四章 讨论
• 4.1 spa重组蛋白的表达及活性检测
• 4.2 捕获抗原的抗体选择
• 4.3 抗体的制备及效价
• 4.4 抗体纯化
• 4.5 胶体金颗粒的制备
• 4.6 免疫胶体金探针的制备
• 4.7 免疫胶体金试纸条性能测试
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历