D-塔格糖3-差向异构酶的研究 ——细菌筛选、酶分离纯化及克隆表达

论文摘要

稀有糖是自然界存在极少的单糖及其衍生物的总称,具有独特的保健功能和潜在的医疗价值。D-塔格糖3-差向异构酶（D-tagatose 3-epimerase,DTE,EC5.3.1.-）家族是稀有糖生物转化法制备的关键酶。本文以探索新的DTE家族为目标,分为菌种筛选、发酵条件优化、酶分离纯化及酶学性质和基因克隆表达及酶学性质4个步骤展开工作。主要结果如下:1.筛选获得一株可产D-塔格糖3-差向异构酶的菌株SK011,通过形态观察、生化特性、16S rDNA序列比对,鉴定为类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides,R. sphaeroides）,定名为R. sphaeroides SK011;2. R. sphaeroides SK011液体发酵生产DTE的最适培养基和发酵条件为:碳源为葡萄糖,浓度为1%,氮源为酵母膏和胰蛋白胨,浓度分别为2%和1.25%,氯化钠0.3%,二水磷酸二氢钠0.3%,硫酸镁0.05%,培养初始pH 7.0;在发酵初始添加0.2%D-塔格糖作为诱导物;种龄24 h,装液量为20 mL/250 mL,接种量3%,30°C、180 rpm、避光,发酵时间36 h;3.粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose CL 6B Fast Flow离子交换色谱和Superdex 75凝胶过滤等步骤,分离纯化得到DTE,比酶活提高26.8倍,达到13.4U/mg,经SDS-PAGE鉴定达到电泳纯,由2个相同的亚基组成,分子量为64 kD;4.酶学性质测定结果显示,该酶最适作用温度40℃,最适pH值9.0,在40℃以下,pH 8-10之间保持稳定;Mn2+对酶活力有促进作用,Cu2+、Zn2+对酶活力有不同程度的抑制作用;对D-塔格糖底物专一性最强;该酶N-端氨基酸残基序列依次为MKNPVGIISM,与目前已确定DTE家族均不一致,NCBI中仅检索得到与之具有相同N-端氨基酸残基的计算注明（Conceptual translation）序列:Rsph170293406,这是R. sphaeroides中首次发现的DTE家族,定名为R. sphaeroides DTE;5.成功克隆Rsph170293406基因,插入表达载体pET-22b（+）,转入表达宿主E. coli BL21（DE3）,构建重组菌株E. coli BL21（DE3）（pET-dte）,诱导表达得到具有DTE的功能的重组蛋白,在pH 9.0和40℃条件下表现最大酶活,在40℃以下,pH 8-10间保持稳定;Mn2+对酶活力有促进作用,Cu2+、Zn2+对酶活力有不同程度的抑制作用,以上酶学性质与野生型R. sphaeroides DTE一致,说明Rsph170293406基因在E. coli BL21（DE3）（pET-dte）表达系统中进行转录、翻译后折叠成为具有活性的R. sphaeroides DTE蛋白高级结构;确定Rsph170293406基因为R. sphaeroides DTE的编码基因,在GenBank数据库登记,基因登记号为FJ851309,对应蛋白质编号ACO59490;6.重组R. sphaeroides DTE对D-果糖底物专一性最强,其次为D-塔格糖,与野生型酶不同;7.在pH 9.0,40℃条件下测得D-阿洛酮糖与D-果糖之间差向异构反应平衡常数为23:77。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 稀有糖
• 1.2 D-塔格糖3-差向异构酶及相关微生物的发现和发展
• 1.3 DTE 家族酶学性质极其晶体结构
• 1.3.1 DTE 家族酶学性质
• 1.3.2 A. tumefaciens DPE 晶体结构
• 1.3.3 P. cichorii DTE 晶体结构
• 1.4 DTE 应用研究进展
• 1.4.1 利用DTE 催化己酮糖间的异构
• 1.4.2 利用DTE 和多元醇脱氢酶实现己酮糖与己糖醇之间的互相转化
• 1.4.3 利用DTE、多元醇脱氢酶、醛糖异构酶和醛糖还原酶实现所有己糖之间的转化——Izumoring 策略
• 1.4.4 DTE 在其他稀有糖制备中的应用
• 1.5 本课题的立题依据和意义
• 1.6 本课题研究内容
• 参考文献
• 第二章 D-塔格糖3-差向异构酶产生菌株的分离、筛选及鉴定
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要材料
• 2.2.2 试验仪器
• 2.2.3 主要实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 筛选结果
• 2.3.2 产物鉴定
• 2.3.3 SK011 165 rDNA 序列测定
• 2.3.4 SK011 菌株的特征
• 2.3.5 SK011 的生理生化特征
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 类球红细菌产酶发酵条件优化
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 主要实验仪器
• 3.2.3 实验方法
• 3.2.4 分析方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 不同培养方式SK011 的生长曲线、产酶曲线比较
• 3.3.2 种子生长曲线
• 3.3.3 发酵培养基优化
• 3.3.4 发酵条件优化
• 3.3.5 发酵诱导条件
• 3.3.6 产酶进程
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 类球红细菌D-塔格糖3-差向异构酶的分离、纯化及酶学性质
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种及保藏方法
• 4.2.2 主要实验材料
• 4.2.3 主要实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 酶的分离、纯化
• 4.3.2 DTE 及其亚基分子量测定
• 4.3.3 DTE 酶学性质测定
• 4.3.4 N-端结构测定
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 类球红细菌D-塔格糖3-差向异构酶的基因克隆、表达及酶学性质
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌种与质粒
• 5.2.2 培养基
• 5.2.3 主要试剂
• 5.2.4 主要仪器
• 5.2.5 主要试验方法
• 5.3 结果与讨论
• 3406 基因的克隆'>5.3.1 Rsph17029₃406 基因的克隆
• 3406 基因表达载体构建'>5.3.2 Rsph17029₃406 基因表达载体构建
• 5.3.3 E. coli BL21（DE3）（pET-dte）的PCR 验证
• 5.3.4 表达产物的SDS-PAGE 验证
• 5.3.5 重组蛋白表达、纯化
• 5.3.6 重组蛋白的分子量
• 5.3.7 重组蛋白的性质
• 5.3.8 重组R. sphaeroides DTE 催化的D-果糖与D-阿洛酮糖之间差向异构反应平衡常数测定
• 5.3.9 R. sphaeroides DTE 基因的测序及序列分析
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 论文主要结论
• 论文创新点
• 附录
• 1.N-端结构分析图谱及标准氨基酸分析图谱
• 2.NCBI 数据库中提交的R. sphaeroides SK011 165 rDNA 基因信息
• 3.NCBI 数据库中提交的R. sphaeroides SK011 产D-塔格糖3-差向异构酶基因及编码蛋白质的信息
• 致谢
• 在攻读博士学位期间发表的论文成果