结核分枝杆菌KatG基因突变与异烟肼耐药的关系

论文摘要

研究背景及目的结核病是由结核分枝杆菌（MTB）感染引起的慢性传染性疾病,据WHO估计在全球约有18-22亿的人感染MTB,其中大约有6500万人感染MTB耐药菌株。我国结核的耐药情况尤为严重,总耐药率为29.8%,耐多药率高达12.7%,由此造成的结核病患病率和死亡率居高不下。因此,MTB的耐药机制研究成为结核病研究工作的当务之急。研究表明异烟肼耐药相关基因中最主要的基因为KatG基因,KatG基因的变异（包括突变,缺失等）导致的结核杆菌过氧化物酶活性降低或缺失可以解释90%以上的异烟肼（INH）耐药,但有研究发现某些菌株也可能与其无关,是其它耐药基因所致或存在多种机制,尚需进一步探讨。本研究采用制造突变和修复突变的方法,在结核分枝杆菌标准株上制造KatG基因的缺失,在结核分枝杆INH耐药株上修复突变位点,在结核分枝杆菌INH敏感株上引导突变,然后检测基因重组株的耐药性,观察突变与耐药性之间的联系。材料与方法1、菌株、质粒来源。结核分枝杆菌标准菌株H37Rv由本实验室保存。质粒pKD46由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所韩延平博士惠赠。2、菌株培养。采用改良罗氏固体培养基（L-J）和Middlebrook 7H9液体培养基相结合的方法培养。3、实验用DNA片段的准备用于敲除DNA片段Knockout的准备:用融合PCR方法将KatG两侧片段KatG-pre与KatG-post连接组成KatG基因敲除片段Knockout;用于修复耐药基因DNA片段Repair的准备:以筛选出的异烟肼耐药株DNA为模版使用带有修复位点的引物扩增出耐药基因位点的修复片段;用于引导突变DNA片段Lead的准备:以筛选出的异烟肼敏感株DNA为模版使用带有引导突变的引物扩增出引导突变基因位点的修复片段。4、菌株DNA片段的导入。将质粒pKD46导入H37Rv菌株、耐药株和敏感株菌体中,筛选质粒导入阳性菌株26℃培养至对数生长期,将敲除片段Knockout、修复片段Repair和引导突变片段Lead分别导入各菌体中。5、鉴定各重组株基因重组结果。试剂盒法提取DNA,用引物扩增目的基因,送测序鉴定。6、鉴定各重组株基因异烟肼药敏结果结果将标准株katG基因敲除株、耐药菌修复株和敏感菌引导突变株进行药敏检测,计算耐药百分比。结果1.培养结果:固体改良罗氏培养基（L-J）和液体Middlebrook 7H9培养基培养的结核分枝杆菌菌株生长良好。2.各重组菌株的构建:序列分析结果确证了KatG基因的敲除株、耐药修复株和敏感引导突变株构建成功。3.耐药分析:药敏结果显示标准株的katG基因被完整敲除后,由完全不耐药变成了80%的耐药。耐药株315位点经过修复后,5株中4株恢复INH的敏感性,而敏感株引导315位突变后,8株中有6株产生耐药性。耐药株463位点经过修复后,6株耐药株仍有5株耐药;而敏感株引导463位点突变后,9株敏感株只有1株敏感株产生耐药性。结论构建了标准株的KatG基因缺失株、异烟肼耐药修复株和异烟肼敏感引导突变株。本研究显示80%的katG缺失株对INH耐药,说明KatG的缺失是结核分枝杆菌耐INH的重要机制;katG315位点变异修复前后和引导变异前后的耐药性变化明显,说明katG基因315密码子的改变与耐药之间有关系;katG463位点变异修复前后和引导变异前后的耐药性变化不明显,这说明INH耐药与463突变无相关性,即463位突变不代表INH耐药。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历