肉仔鸡小肽转运载体的克隆表达及其转运调控研究

论文摘要

本课题研究了肉鸡小肽转运载体不同肠段的发育及分布规律,并克隆,表达、纯化了肽转运载体C端抗原表位区,同时建立了肉鸡肽转运载体cPEPT1外源表达的293-T细胞模型、研究了激素和调节因子对细胞模型中小肽转运载体的调控作用。试验一荧光定量PCR检测肉仔鸡肠道肽转运载体cPEPT1 mRNA方法的建立:根据鸡肽转运载体cPEPT1 mRNA和看家基因18SrRNA序列,分别设计cPEPT1和18SrRNA引物,建立了包括RNA提取、反转录、PCR的鸡小肠cPEPT1基因表达检测方法,并通过模板浓度、引物浓度及退火温度等条件的摸索进行了试验条件的优化,试验二实时定量PCR评定肉鸡小肠PEPT1 mRNA基因发育变化:分析不同日龄肉仔鸡小肠不同肠段肽转运载体PEPT1 mRNA的发育规律。选用1日龄商品代雄性Arbor Acre （AA）肉鸡100羽,随机分为5组,采用实时定量PCR法研究肉鸡肠道表达的肠段差异;以9、18、27、36、45日龄AA肉鸡十二指肠、空肠、回肠样品为模板研究肉鸡肠道肽转运载体（Peptide transporter1, PEPT1） mRNA表达发育变化。结果表明:AA肉鸡PEPT1 mRNA的表达丰度从十二指肠、空肠到回肠依次降低;AA鸡PEPT1 mRNA在十二指肠及空肠发育规律表现出相反趋势,十二指肠9、18、27丰度较高,其中27日龄显著高于45日龄,而空肠36、45表达丰度较高,显著高于9、18日龄丰度。试验三实时定量PCR评定北京油鸡小肠PEPT1mRNA基因发育变化:分析不同日龄北京油鸡小肠不同肠段肽转运载体PEPT1 mRNA的发育规律。选用1日龄雄性商品代北京油鸡100羽,随机分为5组,采用实时定量PCR法研究肉鸡肠道表达的肠段差异;以18、36、54、72、90日龄北京油鸡十二指肠、空肠、回肠样品为模板研究肉鸡肠道肽转运载体1 mRNA表达发育变化。结果显示: （1）北京油鸡肠道PEPT1 mRNA的表达丰度从十二指肠、空肠到回肠依次降低;北京油鸡PEPT1 mRNA在十二指肠与空肠、回肠发育规律不同,十二指肠18、36日龄丰度较高,显著高于54、72及90日龄的相应值,其中18日龄表达量最高,而72日龄最低;空肠90日龄时PEPT1 mRNA表达量最高,显著高于18、36日龄的相应值,而在54、72日龄时的表达丰度则高于18、36日龄,但结果不显著;回肠PEPT1 mRNA表达量以72日龄时最高,54、72及90日的表达量龄显著高于18、36日龄时的表达量。试验四北京油鸡cPEPT1基因编码区的克隆:试验成功构建了重组载体pEASY-T3-PEPT1。根据GenBank发布序列设计引物,通过RT-PCR成功从肉鸡空肠肠道粘膜组织中扩增出PEPT1基因,将其克隆进pEASY-T3载体并测定核苷酸序列,经扩增成功获得到测序正确的2145bp的基因。测序结果证明测序和方向均正确,该基因通过基因序列分析包括12个跨膜区一个较大的亲水环,抗原表位区集中于蛋白的C端。试验五鸡PEPT1抗原表位基因的原核表达及序列鉴定:表达并纯化鸡肠道肽转运载体PEPT1抗原表位区。根据GenBank的原鸡PEPT1保守区序列设计引物,提取鸡十二指肠道黏膜总RNA进行反转录,以合成的cDNA为模板,PCR扩增PEPT1抗原表位区序列后与pEASY-T3载体进行T克隆;测序正确后,采用定向克隆的方法将PEPT1抗原表位区基因连接到pET22B+载体上,成功构建了pET-22B-PEPT1重组质粒。将重组质粒克隆转化到原核表达宿主Rosetta （DE3）中。诱导蛋白表达,并通过SDS-PAGE和Westernblot及质谱测序验证。构建得到原核融合重组载体pET22B-6His-PEPT1;诱导后表达得到6His-PEPT1融合蛋白,纯化得到表达产物并进行了初步的鉴定,所得产物经质谱分析其序列正确。试验六鸡肠道肽转运载体抗原表位基因毕赤酵母表达系统的构建:根据GenBank发布序列设计引物,从鸡空肠肠道粘膜组织中扩增出PEPT1基因,将其克隆进pEASY-T3载体并测定核苷酸序列,设计一对PEPT1抗原表位区段外源表达的PCR引物,利用已得到得的全长目的基因（2145）pEASY-T3 -PEPT1载体为模板,设计酶切位点为EcoRⅠ和NotⅠ,扩增出目的片断。将该片段克隆到pPIC9K载体,通过重组质粒酶切验证、菌落PCR鉴定,证明得到的阳性重组质粒含有目的基因片段,抗原表位区1000bp,。将抗原表位区基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,测序结果证明测序和方向均正确,并将其命名为pPIC9K-PEPT1（s）。通过诱导蛋白序列正确。试验七北京油鸡PEPT1基因编码区的克隆及其在HEK293-T细胞的转染条件优化:通过本试验,我们构建了北京油鸡PEPT1的真核pcDNA3-PEPT1,并且同时为了检测转染体系的状态,同时建立了绿色荧光蛋白的共转染体系,通过对HEK293-T的生长条件优化,确定了最佳转化时间及转化条件,为建立细胞模型建立了基础。试验八北京油鸡肠道肽转运蛋白PEPT1基因表达载体在293-T细胞的表达鉴定:本试验通过分子生物学手段建立了北京油鸡PEPT1细胞模型。根据GenBank的原鸡PEPT1保守区序列设计引物,从北京油鸡肠道粘膜组织中扩增出PEPT1基因,将其与pEASY-T3载体连接并测定核苷酸序列,成功获得到测序正确的2145bp的基因,并将北京油鸡肠肽转运载体PEPT1基因克隆到真核表达载体pcDNA3.0,构建了真核表达载体pcDNA3-PEPT1。采用脂质体介导将表达质粒pcDNA3-PEPT1转染293-T细胞,同时转染pcDNA3.0-EGFP荧光蛋白进行转染体系荧光监测,流式细胞术检测转录后16h、20h、24h的荧光强度。分别在16h、20h、24h、44h收集等量转染细胞,抽提转染细胞总RNA,DNAseⅠ处理残留的DNA污染,反转录合成cDNA,以构建不同稀释度的pEASY-T3-PEPT1质粒为模板,建立SYBERGREEN实时荧光定量标准曲线,检测PEPT1在293-T细胞中的转录水平。结果表明,在质粒转染入293-T细胞后,在16h、20h、24h、44h均有稳定的转录水平。从而建立了在293-T细胞表达北京油鸡PEPT1的外源模型。试验九北京油鸡肠道肽转运蛋白PEPT1基因表达载体在293-T细胞的转运调控:通过克隆北京油鸡cPEPT1基因在293-T细胞中进行瞬时表达,检测重组蛋白cPEPT1的异源转运甘亮肽活性。方法:培养293-T细胞待细胞生长至90-95%融合时,以胰酶消化稀释1:2传代至24孔板,待细胞融合度达到约95%,将构建好的重组pcDNA3-cPEPT1采用脂质体转染法导入293-T细胞,每孔质粒添加量1ug,Real-Time PCR检测mRNA表达,同时在PEPT1导入后22h加入3H标定的甘亮肽孵育液,孵育液中添加H+、GH及胰高血糖素,分别在30、60min中止反应,液闪仪测定孵育液放射性。结果:用Real-Time PCR法检测表明293-T细胞可表达cPEPT1;在表达细胞中,与H+及胰高血糖素相比,生长激素添加有效的促进了表达细胞对甘亮肽的吸收。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 小肽营养理论的提出
• 2 小肽的吸收和转运特点
• 3 小肽转运载体性质及吸收转运途径
• 4 影响动物小肽吸收和转运其它因素
• 5 小肽转运的营养意义
• 6 小肽吸收转运的研究方法
• 7 本论文的立题依据和研究目的
• 第二章 AA 肉仔鸡及北京油鸡肠道PEPT1 分布研究
• 试验一、肉仔鸡肠道肽转运载体mRNA 检测荧光定量PCR 方法的建立
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 试验二、实时定量PCR 评定肉鸡小肠PEPT1 mRNA 基因发育变化
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 试验三、北京油鸡小肠PEPT1 mRNA 基因发育变化评定
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 PEPT1 基因的克隆及抗原表位克隆表达
• 试验四、北京油鸡PEPT1 基因编码区的克隆
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 试验五、鸡PEPT1 抗原表位基因的原核表达及序列鉴定
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 试验六、PEPT1 基因在pPIC9K 中的构建及蛋白表达、序列鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第四章 PEPT1 基因的外源表达鉴定及其转运活性研究
• 试验七、北京油鸡PEPT1 基因编码区的克隆及其在293-T 细胞的转染条件优化
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 试验八、北京油鸡肠道肽转运蛋白PEPT1 基因表达载体在293-T 细胞的表达鉴定检测
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 试验九、北京油鸡PEPT1 基因在293-T 细胞中的表达及其转运调控
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第五章 结论
• 1 基本结论
• 2 突出创新点
• 3 有待于进一步研究的问题
• 参考文献
• 附录 肉仔鸡 PEPT1 和 18srRNA 的 mRNA 序列
• 致谢
• 作者简历