不同菌核病（Sclerotinia sclerotiorum）分离物的形态学、致病性和遗传多样性研究

论文题目: 不同菌核病（Sclerotinia sclerotiorum）分离物的形态学、致病性和遗传多样性研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 孙君明

导师: 刘国琴

关键词: 核盘菌,形态特性,生化特性,油菜,遗传多样性,遗传结构,序列

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 核盘菌Sclerotinia sclerotiorum（Lib）de Bary是一种放线状子囊真菌,其寄主范围和地理分布十分广泛,是一种相当严重的世界性植物真菌病害。本研究的主要目的是对不同地区和不同寄主来源的菌核病分离物群体进行形态学、生物化学、致病性和遗传多样性鉴定,以期获得不同菌核病分离物的主要特性差异,为菌核病的系统发育研究和抗性育种提供理论基础。从中国、加拿大、波兰、匈牙利、俄罗斯和斯洛伐克六个国家的三个不同寄主（油菜、胡萝卜和向日葵）上分离了218个菌核病分离物。其中来自中国、加拿大和俄罗斯的分离物是从菌核分离的;来自波兰、匈牙利和斯洛伐克的分离物是利用菌丝体继代培养获得。在PDA固体培养基（φ=18.5 cm）上,对48个菌核病分离物的生长速率和形态学特性进行检测,显示不同地区和寄主来源的大部分菌核病分离物的生长速率都非常快,但不同群体间的平均生长速率显著不同（P<0.05）,合肥群体的平均生长速率最慢,在第四天平均菌落直径仅为11.31cm;而青海群体的平均生长速率最快,在第四天为16.8 cm,变异系数也较低（CV=6.10%）,表明来自青海的菌核病群体菌落的生长速率一致性较好。不同菌核病群体的形态学特性也显著差异,来自合肥群体明显不同于其他群体,但来自相同地区的个体或群体的形态学特性基本相似。就群体而言,不同群体间的菌核干重（P<0.01）、菌核鲜重（P<0.01）、单个菌核重量（P<0.001）、菌核数量（P<0.05）以及干鲜重比（P<0.05）均显著或极显著不同。相关分析显示不同形态学指标之间的相关性明显不同。生长速率与菌核干重呈显著正相关（r=0.30*）;菌核鲜重与干重和单个菌核重量呈极显著正相关(r=0.81**和0.73***);而菌核数量和单个菌核重量呈极显著负相关(r=-0.60***),表明在一定的培养时间内,随着菌核病菌落的逐渐生长,产生菌核的数量、重量也逐渐增加,但菌核的数量越多,单个菌核的重量也相应降低。采用HPLC技术检测草酸分泌量,显示不同分离物分泌的草酸浓度不同。相关性分析发现离体条件下草酸分泌量与生长速率呈负相关（r=-0.403）;与菌核干重和鲜重呈正相关（干重r=0.424;鲜重r=0.436）,但均未达到显著水平;与pH值呈显著负相关（r=-0.517*）,表明在一定范围内,pH值差异可以作为一种草酸含量检测和致病性鉴定的初步参考指标。在两个试验站间（Borowo和Cezekwica）,利用9个菌核病菌株对110个油菜品种（系）进行病情指数（DSI）和病斑长度的综合评价,发现试验站间、菌株间和品种群体间的病情指数和病斑长度极显著不同（P<0.01）,病斑长度在实验站与菌株间的互作显著,病情指数和病斑长度在油菜品种群体与菌株间的互作也达到显著水平,但是病情指数在实验站与菌株间的互作不显著。经病情指数鉴定,油菜品种Pomorzanin和Lisek表现稳定的低发病率,其他大部分品种对菌核病较敏感。相关性分析显示,平均病情指数和病斑长度呈显著正相关,不同菌种间致病性的相关程度变化范围为-0.44-0.90**,且有9个达到显著水平,说明在抗菌核病育种中,油菜品种对某个菌株具有高度抗性,同样也表现出对另外一些菌株的抗病性。对24个不同地区和寄主来源的菌核病分离物的群体结构进行20对RAPD引物分析,显示菌核病分离物的遗传相似性相当高,物种水平的Nei基因多样度h=0.197,Shannon多样性指数I=

论文目录:

缩略词

摘要

Abstract

第一章文献综述

引言

1.1 菌核病(Sclerotinia spp.)的危害

1.2 核盘菌的寄主范围(Host Range)

1.3 核盘菌的侵染循环(Life Cycle)

1.4 菌核病的病症(Symptoms)

1.5 核盘菌的形态学特性(Morphological Characteristics)

1.6 生化成分与致病机理(Biochemical Compounds and Pathogenesis)

1.7 菌核病的防治(Control of Sclerotinia Stem Rot)

1.8 菌核病的分子鉴定(Molecular Determination)

1.9 真菌群体遗传(Fungal Population Genetics)

1.10 菌核病研究的主要问题和意义

1.11 本研究的主要内容

第二章不同菌核病分离物的形态和生理生化特性鉴定

1.引言

2.材料和方法

2.1 菌核病分离物和菌核来源

2.2 培养基的制备

2.3 菌核病分离物的分离和纯化

2.4 菌核病的形态学和菌落生长速率检测

2.5 在液体培养基中菌核病分离物的继代培养

2.6 HPLC鉴定草酸(OA)含量

3.结果与分析

3.1 菌核病分离物的分离和纯化

3.2 菌核病菌落形态学特性差异

3.3 菌落的生长速率差异

3.4 菌核的大小和重量差异

3.5 不同菌核病分离物形态学特性的相关性分析

3.5 液体培养基中菌核病菌落的形态学差异

3.6 离体条件下草酸分泌量的差异

4.小结

第三章不同油菜品种对菌核病的田间反应

1.引言

2.材料和方法

2.1 材料

2.2 方法

3.结果与分析

3.1 油菜菌核病的主要病症

3.2 不同菌核病分离物的致病性评价

3.3 不同油菜品种的病情指数和病斑长度分析

3.4 不同试验小区对菌核病分离物的致病性影响

3.4 不同菌核病分离物之间的致病性的相关性分析

4.小结

第四章不同地区和寄主来源的菌核病分离物群体遗传结构的RAPD分析

1.引言

2 材料和方法

2.1 菌核病(S. sclerotiorum)分离物的来源

2.2 菌核病分离物的形态学和生长速率分析

2.3 真菌DNA的提取

2.4 RAPD分析

2.5 遗传多样性的统计分析

3 结果与分析

3.1 菌核病(S. sclerotiorum)分离物的形态学变异

3.2 RAPD引物和浓度的选择

3.4 菌核病分离物的遗传多样性

3.5 分子方差(AMOVA)分析和变异剖分

3.6 菌核病群体的聚类分析

3.7 菌核病分离物个体的聚类分析

4 小结

第五章应用RAPD和ITS方法研究中国油菜菌核病群体的遗传多样性

1.引言

2 材料和方法

2.1 菌核病(S. sclerotiorum)分离物的来源

2.2 真菌DNA的提取

2.3 RAPD分析

2.4 ITS片段扩增

2.5 ITS片段测序

2.5 遗传多样性的统计分析

3 结果与分析

3.1 RAPD多态性分析

3.2 不同菌核病群体的遗传多样性

3.3 菌核病群体的遗传分化

3.4 菌核病群体的聚类分析

3.5 菌核病分离物个体的聚类和进化分析

3.6 ITS序列的差异比较

4 小结

第六章讨论

1.菌核病菌株的分离与形态特性差异

2.菌核形成的影响因素分析

3.草酸的分泌量与形态特性的关系

4.菌核病形态和生理生化特性与致病性的关系

5.菌核病的致病性与寄主和环境条件的关系

6.菌核病接种鉴定方法对致病性的影响

7.分子鉴定技术在真菌系统发育中的应用

7.1 RAPD在系统发育中的应用

7.2 ITS序列分析在系统发育中的应用

8.居群形态特性与遗传特性的关系

9.菌核病群体的居群遗传结构

10.气候环境与菌核病居群分布

第七章结论

参考文献

附录

致谢

发布时间: 2005-07-18

参考文献

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