论文摘要
猪圆环病毒Ⅱ型（Porcine circovirus 2, PCV2）是目前发现的最小的动物性DNA病毒之一,该病毒病毒粒子无囊膜,为单股环状DNA,呈二十面体对称结构。猪圆环病毒病（PCVAD）在20世纪90年代初期首次被报道,之后法国、美国、韩国、日本等国家也对该病做了详细报道。猪圆环病毒病的发生及发展与PCV2的感染有密切关系,PCVAD包括猪皮炎肾病综合症（PDNS）、仔猪断奶后多系统衰竭综合症（PMWS）、繁殖障碍、猪呼吸道疾病综合症（PRDC）及其他一些相关疾病。目前由PCV2引起的猪圆环病毒相关疾病已对世界养猪业造成了严重的危害。因此,本研究将编码PCV2核衣壳蛋白的ORF2基因作为研究对象,以伪狂犬病毒弱毒疫苗株为亲本毒载体,构建了表达PCV2 ORF2基因的重组伪狂犬病毒PGO株,为探索开发PCV2重组疫苗奠定了基础,为PCV2的防治提供了新的思路与理论依据。为了构建PCV2 ORF2基因重组伪狂犬病毒载体,用BamHI酶切克隆有ORF2基因的质粒pGEMT-ORF2和载体PG质粒并回收,将载体PG去磷酸化后与回收的目的片段ORF2基因连接,构建了重组质粒PGO。通过PCR扩增、酶切、序列测定证明该转移载体构建成功。经酶切鉴定证明插入片断是ORF2基因片断,并证明插入方向正确。用重组的转移质粒和疫苗病毒DNA共转染ST细胞,通过3轮蚀斑筛选及PCR检测,获得了重组病毒。重组病毒的部分生物学特性研究表明：在PK15细胞上病毒增殖滴度为104.125/0.1ml,在ST细胞上病毒增殖滴度为106.125/0.1ml,在VERO细胞上病毒增殖滴度为104.625/0.1ml,在IBRS-2细胞上病毒增殖滴度为106.25/0.1ml。理化特性研究表明：该病毒对氯仿、胰蛋白酶（0.25%）、紫外线照射（30min）、石碳酸（5%）、氢氧化钠（1%）敏感；安全性试验试验结果表明该重组病毒对小鼠是安全的；遗传稳定性研究表明包含有PCV2 ORF2基因的重组伪狂犬病毒具有稳定的遗传性状：RT-PCR、倒置荧光显微镜观察及IPMA试验结果表明插入的基因能够在重组病毒中进行表达。这些研究为研发PCV2病毒重组伪狂犬病毒疫苗奠定了基础。为测定重组病毒对小鼠的免疫试验效果,将商品化PCV2灭活苗、重组病毒、DMEM培养液分别肌肉接种免疫6周龄雌性昆明小鼠,四周后加强免疫一次。从一免后第三周每周抽取外周血,应用ELISA检测免疫后小鼠的体液免疫情况。一免后第八周每组处死5只小鼠做PCV2特异性淋巴细胞增殖实验,每组剩余的5只用PCV2强毒进行攻毒试验并在攻毒后两周处死小鼠进行特异性PCV2 ORF2基因检测。结果显示首免后PGO重组病毒免疫组小鼠体内PCV2特异性抗体水平很低,但是二免后所有小鼠PCV2特异性抗体水平明显升高,另外淋巴细胞增殖实验表明,重组病毒组能够激发PCV2特异的淋巴细胞增殖效应。攻毒实验表明重组疫苗组和PCV2灭活疫苗组均能抵抗PCV2强毒攻击（保护率3/5）,上述结果表明重组病毒具有成为优良疫苗株的潜力。