论文摘要
目的:本研究通过检测博莱霉素（BLM）致特发性肺纤维化（IPF）大鼠模型血液及肺组织中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、内皮素-1（ET-1）、一氧化氮（NO）等指标的变化,运用HE、MASSON染色以及SP免疫组织化学染色等技术手段,研究IPF时氧化损伤的特点以及肺组织病理形态学改变和诱导型一氧化氮合酶（induciblenitric oxide synthase,iNOS）的表达特征,并以益气养阴祛瘀中药进行干预,研究气阴两虚、脉络瘀阻与IPF发病的相关性,探讨益气养阴祛瘀法对IPF的作用机理,为临床治疗提供新的思路和实验依据。方法:将120只Sprague Dawley（SD）大鼠（雌雄各半）置于实验环境中适应性饲养1周后,随机分为5组（每组24只）:①正常对照组（对照组,control group）;②IPF模型组（模型组,model group）;③益气养阴祛瘀方低剂量组（低剂量组,low-dose group）;④益气养阴祛瘀方高剂量组（高剂量组,high-dose group）;⑤强的松组（prednisone group）。根据文献方法,造模各组大鼠气管内滴注博莱霉素A5（BLMA5,5mg/kg,溶于0.2 ml无热源生理盐水）,复制IPF模型;对照组气管内滴注等量无热源生理盐水。手术后第2天始,给对照组与模型组大鼠灌服生理盐水（10ml/kg）;给低剂量组和高剂量组大鼠灌服中药水煎剂（12.3g/kg、24.6g/kg,相当于临床成人用药量的7倍和14倍）;给强的松组大鼠灌服强的松混悬液（6mg/kg）。各组动物于造模后第7d、14d、28d分3批断头处死。取血浆,并分离血清,取肺组织制成10%组织匀浆,5000r/min离心15 min,取上清液,-20℃冻存待检。在肺门处结扎取右肺1cm×1cm×1cm大小组织,用4%多聚甲醛固定、包埋、切片（5μm）,行HE、MASSON及iNOS免疫组化染色,光学显微镜下观察肺组织形态结构以及iNOS的表达情况。检测血液和肺组织中MDA、SOD、ET-1以及NO等指标变化。结果:1一般状态观察对照组大鼠饮食如常,反应灵敏,体毛顺滑光泽,二便正常,无死亡现象。模型组大鼠存在不同程度的咳嗽和呼吸困难,蜷缩少动,精神萎顿,毛发直立,皮毛枯槁,多见倒竖现象。高、低剂量组大鼠,尤其随着用药时间的延长,精神渐趋好转,毛发愈发光整,呼吸渐趋平稳,活动增多,食量增加,高剂量组大鼠总体状态好于低剂量组;强的松组大鼠状态亦趋好转。2各组大鼠血清及肺组织中MDA含量与SOD活力变化2.1各组大鼠血清及肺组织中MDA的含量结果显示,与对照组相比,模型组大鼠血清及肺组织中MDA的含量于7d、14d、28d,均明显升高（均P<0.01）。经用药干预,与模型组相比,高剂量组血清及肺组织中MDA含量7d、14d、28d时均有明显降低（P<0.05或P<0.01）;低剂量组血清中含量7d、14d、28d时与模型组相比未见显著性差异（P>0.05）,低剂量组肺组织中MDA含量7d、28d时有明显减低（P<0.01）;强的松组血清中MDA含量7d、14d、28d时与模型组相比,有明显减低（P<0.05或P<0.01）,肺组织中MDA含量7d、28d时明显降低（P<0.01）,14d时肺组织中MDA含量则未见显著性差异（P>0.05）。三治疗组之间相比,未见显著性差异（P>0.05）（见Table1、Table2）。2.2各组大鼠血清及肺组织中SOD的活力结果显示,与对照组相比,模型组大鼠血清中SOD活力7d、14d和28d时明显降低（P<0.01）,肺组织中SOD活力7d、14d明显降低（P<0.01）,28d时肺组织中的SOD活力未见显著性差异（P>0.05）。经用药干预,与模型组相比,高剂量组7d、14d时血清及肺组织中SOD活力有明显升高（P<0.05或P<0.01）,28d时血清SOD活力明显升高（P<0.01）,肺组织中SOD活力未见显著性差异（P>0.05）;低剂量组血清中SOD活力14d、28d时显著升高（P<0.01）,7d、14d时肺组织中SOD活力与模型组相比显著升高（P<0.05或P<0.01）;强的松组血清及肺组织中SOD的活力7d时显著升高（P<0.05或P<0.01）,14d、28d时未见显著性差异（P>0.05）。三治疗组之间相比,高剂量组14d、28d时血清中SOD活力较强的松组明显升高（P<0.05）,14d时肺组织中SOD的活力较强的松组明显升高（P<0.05）;低剂量组血清中SOD活力28d时较强的松组明显升高（P<0.05）。见Table3、Table43各组大鼠血液及肺组织中ET-1与NO的含量变化3.1各组大鼠血浆及肺组织中ET-1的含量结果显示,与对照组比较,模型组大鼠血浆及肺组织中ET-1的含量明显升高（P<0.01）。经用药干预,与模型组相比,7d、14d和28d时,三治疗组血浆及肺组织中ET-1的含量显著降低（P<0.05或P<0.01）。三治疗组之间相比,7d时高剂量组肺组织中ET-1的含量与强的松组相比明显降低（P<0.01）;14d高、低剂量组血浆中ET-1的含量与强的松组相比明显降低（P<0.01）（见Table5、Table6）。3.2各组大鼠血清及肺组织中NO的含量结果显示,与对照组相比,模型组大鼠血清及肺组织中NO的含量明显升高（P<0.01）。经用药干预,与模型组相比,7d、14d和28d时,各治疗组NO的含量均降低明显（P<0.05或P<0.01）。三治疗组之间比较,高剂量组与强的松组相比,7d血清、14d肺组织和28d血清中NO含量显著降低（P<0.05或P<0.01）;7d低剂量组血清中NO的含量与强的松组相比显著降低（P<0.01）（见Table7、Table8）。4各组大鼠肺组织病理形态学改变4.1肉眼观察:对照组大鼠双肺外观无异常,肺叶轮廓清晰,表面光滑、粉红色、弹性良好。模型组第7d大鼠双肺见密集的点状出血,灶状淤斑,肺体积增大;第14d时,双肺灰白色,局部见大小不等结节样改变,边缘有点状出血,部分肺叶体积缩小,表面有白色结节;第28d大鼠双肺苍白,体积缩小,硬度增加,表面结节样改变、串珠状充气空泡及条索状凹沟。高、低剂量组与强的松组大鼠肺组织部分呈暗红色,偶见大小不等结节样改变,边缘有点状出血及部分肺叶体积缩小。4.2光镜下观察模型组大鼠可见肺泡腔及肺间质弥漫性炎细胞浸润,肺泡间隔增宽,部分区域肺泡隔断裂,肺泡萎陷、甚至结构消失,部分肺泡代偿性气肿,且病变随时间延长而有所加重;至后期均发生肺间质纤维化,且多为中重度;MASSON染色下可见到肺间质中胶原纤维显著增多。经用药干预,各治疗组大鼠肺泡炎和肺纤维化程度均较模型组大鼠明显减轻;高剂量组大鼠肺泡炎和肺纤维化减轻程度高于低剂量组和强的松组（见Fig.1-4）。5各组大鼠肺组织iNOS的表达特征对照组大鼠肺组织冰冻切片及阴性对照切片上,肺间质细胞内几乎未见iNOS蛋白表达阳性信号;第14 d模型组大鼠肺间质中出现明显表达的iNOS蛋白阳性细胞表达,阳性信号均呈棕黄色。高剂量组与强的松组细胞胞浆呈现较弱的阳性反应;高剂量组iNOS表达呈现较弱的阳性信号;低剂量组阳性信号较模型组无显著差异（见Fig.5-6）。结论:1 IPF时机体MDA含量增加,SOD活力降低,表明机体氧化-抗氧化失衡是其发病的重要机制,自由基直接参与了IPF的形成过程。益气养阴祛瘀方药能有效降低MDA含量,增加SOD活力,从而影响IPF的形成过程。2 IPF时大量产生的NO造成血管通透性增大,其结果加重了气道的炎症反应和组织损伤;而ET-1作为前纤维化因子在IPF状态下的过量增加,加剧了组织损伤程度。益气养阴祛瘀方药能通过降低ET-1、NO的合成与释放,改善机体血行状态,延缓肺纤维化的进程。3机体发生IPF时,肺组织中iNOS呈现高表达特征;益气养阴祛瘀方药能够有效下调其表达水平,减轻NO升高造成的组织损伤,对IPF发挥治疗作用。
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