碱性木聚糖酶高产酵母菌株的选育

论文摘要

木聚糖酶是降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称,在食品、饲料、制浆、造纸等工业中有着广泛的应用前景。为了能够提高木聚糖酶的产量,增强其生物反应催化能力,更好的利用木聚糖酶的优良生物特性,筛选适合工业生产应用的木聚糖酶高产菌株以实现产业化大规模应用势在必行。本实验在前期工作已获得整合有表达载体pHBM905A-xynHB的重组子GS115-905-XYNHB1的基础上,构建含有目的基因xynHB的重组毕赤酵母表达载体pPICZa A-xynHB,将这一重组表达质粒经酶切线性化以后,电转化至的毕赤酵母GS115-905-XYNHB1中,涂布在含有不同浓度Zeocin抗生素的YPD平板上,筛选获得转化子pHBM905A-XYNHB-pPICZaA-XYNHB1-6。对筛选得到的6个pHBM905A-XYNHB-pPICZa A-XYNHB重组子进行摇瓶诱导发酵,测得6个重组子的酶活分别为1236U/ml、1198U/ml、1065U/ml、1024U/ml、996U/ml、1089U/ml,相比较原始菌株GS115-905-XYNHB1的发酵酶活547U/ml,酶活产生了显著提高。对酶活最高的1号菌进行50L发酵罐放大中试,木聚糖酶酶活达到10000U/ml以上。为了确定1—6号菌株中目的基因xynHB的拷贝数,我们通过Real-time PCR测定了六个重组菌株的目的基因和参照基因的CT值,根据结果计算出拷贝数。相对于单拷贝GS115-905-XYNHB1,计算结果显示6个重组菌株的拷贝数依次分别为3,3,2,2,2,2。综上所述,本实验利用毕赤酵母表达载体的不同选择标记,在整合有木聚糖酶基因xynHB的一代转化子GS115-905-XYNHB1的基础上,转入第二种重组载体pPICZa A-xynHB,得到二代转化子pHBM905A-XYNHB-pPICZa-XYNHB,根据不同浓度的Zeocin抗性筛选,就可以获得产木聚糖酶高表达菌株。此种筛选方式也可以用来筛选其他产酶菌株或者是蛋白表达菌株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 前言
• 1.1 木聚糖和木聚糖酶的相关介绍
• 1.1.1 木聚糖的结构
• 1.1.2 木聚糖酶的性质和特点
• 1.1.3 木聚糖酶的国内外研究进展
• 1.1.4 碱性木聚糖酶的用途和开发利用的意义
• 1.2 毕赤酵母表达系统
• 1.2.1 酵母表达系统的组成
• 1.2.2 相关宿主菌
• 1.2.3 相关表达载体
• 1.2.4 表达载体在毕赤酵母中的整合
• 1.2.5 转化方式
• 1.2.6 获得高拷贝数整合转化子的一般方法
• 1.2.7 毕赤酵母表达外源基因的优点
• 1.2.8 温度和PH对毕赤酵母表达的影响
• 1.2.9 信号肽对毕赤酵母表达的影响
• 1.2.10 毕赤酵母表达菌株的培养条件的优化
• 1.3 本实验前期工作
• 1.4 实验目的
• 第二部分 材料与方法
• 2.1 实验材料和仪器设备
• 2.1.1 实验菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 质粒
• 2.1.4 引物
• 2.1.5 酶和试剂
• 2.1.6 仪器和设备
• 2.1.7 主要缓冲液
• 2.2 方法
• 2.2.1 质粒DNA的抽提
• 2.2.2 质粒DNA的双酶切
• 2.2.3 凝胶回收目的DNA片段
• 2.2.4 溶液回收目的DNA片段
• 2.2.5 载体和片段的连接
• 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.7 大肠杆菌重组子的筛选
• 2.2.8 毕赤酵母感受态细胞的制备及转化
• 2.2.9 多拷贝转化子的筛选
• 2.2.10 重组毕赤酵母在底物平板上的诱导表达
• 2.2.11 外源基因在毕赤酵母中的高密度诱导表达
• 2.2.12 酶解液中还原糖含量的测定（DNS法）
• 2.2.13 Realtime PCR检测重组拷贝数
• 2.2.14 转化子遗传稳定性实验
• 2.2.15 重组木聚糖酶酵母菌株50升发酵罐的小试发酵
• 第三部分 结果与分析
• 3.1 含有木聚糖酶基因xynHB毕赤酵母表达质粒的构建
• 3.2 xynHB基因在毕赤酵母中的表达及表达产物分析
• 3.2.1 重组质粒pPICZaA-xynHB的功能验证
• 3.2.2 pPICZaA-xynHB向毕赤酵母GS115-905-xynHB1的转化
• 3.2.3 毕赤酵母重组子的挑取及诱导表达
• 3.3 Realtime PCR检测 赤酵母拷贝数
• 3.4 转化子遗传稳定性试验
• 3.5 50升发酵罐的小试生产应用
• 第四部分 讨论与展望
• 参考文献
• 致谢