论文摘要
兔病毒性出血症（RHD）是由兔病毒性出血症病毒（RHDV）引起的兔的传染性疾病,病程短,死亡率高,可造成养兔业的巨大经济损失。VP60蛋白是RHDV唯一的结构蛋白,在动物体内可诱导产生中和抗体,与免疫反应直接相关。目前广泛使用的RHDV疫苗为组织灭活苗,虽然长期以来一直具有良好的免疫效果,但其自身具有不可避免的种种缺陷。由于兔病毒性出血症病毒在体外组织细胞的培养方法尚未建立,所以近年来,人们对RHDV疫苗的研制主要着眼于基因工程苗的研制,其既能起到免疫预防作用,又能很好的解决组织灭活苗的种种缺陷。因此,本研究利用RT-PCR技术把VP60基因克隆入腺病毒表达载体系统中,构建成重组腺病毒,使VP60基因获得表达,并研究其抗原性和免疫原性,以期为研究RHDV重组腺病毒疫苗奠定基础。本研究据GeneBank数据库德国标准株的基因序列（M67473）,设计合成了一对针对VP60基因的特异性引物,在上游引物的5’端加入Kpn I酶切位点和起始密码子,下游引物的5’端加入Xho I酶切位点和终止密码子。用RT-PCR技术从上海RHD兔的肝脏内扩增出大小为1740bp的PCR产物,经纯化后与PMD19-T载体连接,转化DH5α,然后在氨苄抗性（Amp+）平板上挑取阳性菌落,过夜培养,提取质粒,经Kpn I和Xho I双酶切鉴定后进行DNA序列测定。用DNAStar软件分析结果表明:扩增片断与预期片断大小相符,完全符合载体阅读框。该株VP60基因序列（命名为SH-VP60）与国内外其它分离株同源性为90.2%98.2%。将目的基因亚克隆至穿梭载体pShuttle-CMV ,得到重组质粒pShuttle-VP60,转化到宿主菌E.coli DH5α中,提取阳性克隆质粒,与骨架载体pAdEasy-1按一定比例混合,通过电转化转入E.coli BJ5183中,使它们在E.coli BJ5183中发生同源重组,从而使所克隆入穿梭载体内的VP60基因进入腺病毒骨架载体。转化后的E.coli BJ5183经卡那霉素筛选得到阳性重组质粒pAd-VP60。Pac I酶单酶切线性化后,在脂质体转染试剂介导下,转染HEK293细胞,转染后观察细胞病变,当出现明显的细胞病变时,收获病毒。经IFA、SDS-PAGE和Western-blotting等鉴定,重组腺病毒VP60蛋白（约60KDa）在HEK293细胞中得到表达。利用重组腺病毒表达的RHDV衣壳蛋白接种免疫2月龄以上非RHD免疫兔,结果显示该表达的重组衣壳蛋白在免疫后22天可以诱导兔体产生抗RHDV抗体,其诱导的血凝抑制抗体效价介于24至27之间。该抗体可以提供足够的免疫保护力以抵抗血凝价为210以上的致死剂量RHDV强毒的攻击。
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相关论文文献
- [1].猪细小病毒7型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及临床样品的检测[J]. 中国兽医学报 2019(10)