猪圆环病毒衣壳蛋白核定位信号对其复制的影响及突变体病毒的免疫原性研究

论文摘要

猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）属于圆环病毒科,圆环病毒属,无囊膜,直径约17nm,是最小的动物病毒之一,其因组为一单链环状DNA。PCV分为两个基因型,PCV1无致病性,广泛存在于猪群中。而PCV2被认为是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要致病因子,可引起消瘦、可视黏膜苍白、呼吸困难、间歇性腹泻及淋巴结肿胀等症状,对养猪业构成了严重威胁。PCVl和PCV2均包含ORF1、ORF2和ORF3三个主要的开放阅读框。其中ORF2编码病毒的衣壳蛋白,并且是PCV2的主要毒力因子和免疫原性蛋白。研究表明,植物单链环状病毒核衣壳蛋白核定位信号（NLS）的破坏或缺失直接导致ssDNA积聚减少,从而影响病毒的复制增殖。核衣壳蛋白有可能通过与复制相关蛋白的作用而参与调节病毒基因组的复制。对PCV2核衣壳蛋白的研究将有助于深入了解病毒复制、致病性,开发有效的病毒疫苗。而猪圆环病毒2型（PCV2）是引起猪多系统衰竭综合征的病原之一,严重影响养猪业的健康发展,目前还没有有效疫苗。本项目以PCV2 ORF2为基础,在对浙江省及周边地区猪场PCV2感染血清学和分子流行病学调查的基础上,比较深入地开展了PCV核衣壳蛋白核定位信号对PCV2复制的影响和重组病毒的免疫原性研究。由于该病毒在体外培养细胞中的增殖较慢,是影响疫苗研发的瓶颈问题,本研究针对PCV2复制问题开展的研究,具有重要的理论和实际意义。首先,分别应用PCR和ELISA方法对2003-2007年浙江省及其周边上海、江苏等地猪场采集的169份病猪组织和1779份血清进行了PCV2及其特异性抗体的检测。结果显示,淋巴结中PCV2的PCR阳性率为52.07%（88／169）,猪群PCV2抗体阳性率为46.0%（819／1779）。其中断奶后仔猪（54.1%,223／412）和肥育猪血清（49.9%,423／848）PCV2抗体阳性率显著高于哺乳仔猪的阳性率（33.3%,173／519）。进一步扩增27株2004-2007年不同地区PCV2毒株的ORF2基因,进行测序并分析其分子流行特点。结果显示该地区PCV2毒株彼此间核苷酸的同源性较高（98%-100%）,但与国内其它地区或国外毒株相比具有明显的氨基酸变异,特别是衣壳蛋白的两个主要抗原表位区内氨基酸位点变异率非常高,导致其亲水性发生明显改变。遗传进化分析发现该地区的所有PCV2毒株与部分国内毒株处于同一分支内,而与大部分国内或国外的PCV2毒株亲缘关系较远。以上结果说明PCV2感染在浙江省及周边省市呈广泛流行并呈上升趋势,而且其毒株具有独特的分子特征。PCV衣壳蛋白在胞浆内合成后通过其自身核定位信号的作用转运至细胞核内参与病毒的复制和组装。预测结果表明PCV1 ORF2蛋白的N端也含有多个可能的单一型或双分型核定位信号序列（NLS）。本研究将PCV1 ORF2及其突变体与eGFP融合,插入真核表达质粒pcDNA3,使其能融合表达两个不同基因。转染细胞后观察荧光,以分析和确证PCV1 ORF2蛋白中的核定位元件。试验结果表明,PCV1 ORF2蛋白C端190个氨基酸缺失后不影响融合蛋白的核定位,即蛋白均集中于细胞核内,与野生型ORF2-EGFP融合蛋白一致。而其N端43位氨基酸序列的缺失导致融合蛋白丧失了核定位功能而使蛋白散布于PK-15细胞的胞浆内。这说明PCV1 ORF2蛋白的核定位功能由其N端序列决定。进一步对N端NLS序列中的碱性氨基酸残基分别进行点突变,结果表明氨基酸短肽9RRRR12的突变和25RRPYLAHPAFRNRYRWRRK43中后6个碱性氨基酸的突变导致融合表达产物分布于整个细胞,丧失了完整的核定位功能,说明这两个序列为PCV1 ORF2蛋白的核定位元件,与PCV2 ORF2蛋白的NLS有较大差异。应用反向遗传学技术可以详细研究病毒的基因结构和编码蛋白的功能。我们将PCV2基因组克隆入pUC-18载体,并在其3’端亚克隆入一段重复序列,构建了mPCV2感染性克隆。其中的重复序列有助于DNA在细胞内通过同源重组自身环化并从质粒中释放。以同样策略构建了PCV1基因组为骨架、含有PCV2ORF2的杂合型PCV12感染性克隆以及PCV2 ORF2核定位信号序列（NLS）被PCV1 ORF2相应序列替换的PCV2-2NLS1和PCV12-2NSL1两种杂合型感染性克隆,以研究PCV核定位信号元件对于病毒复制的影响。结果表明4个感染性克隆转染PK-15细胞后均能产生感染性的病毒粒子。连续传代稳定后,mPCV2和PCV12病毒分别能达到105.5和105TCID50/ml,滴度与野毒株PCV2相似。而杂合病毒PCV2-2NLS1和PCV12-2NLS1的滴度则显著低于野毒PCV2（103.5TCID50/ml）。mPCV2和PCV12要比PCV2-2NLS1和PCV12-2NLS1在PK-15细胞具更强的复制能力：mPCV2和PCV12从感染后12h的102TCID50/ml达到96h时的104TCID50/ml左右,但PCV2-2NLS1和PCV12-2NLS1只达到103TCID50/ml左右。将各重组病毒以相同剂量接种8周龄的BALB/c小鼠,比较它们在体内的复制能力、致病性和免疫原性差异。虽然mPCV2组小鼠血清中病毒含量显著高于PCV12接种组,但它们诱导的血清抗体效价没有显著差异,表明它们在体内具有相似的免疫原性。而PCV2-2NLS1和PCV12-2NLS1组小鼠只有少数能从血清中检测到低水平的病毒量和PCV特异性抗体。致病性试验发现各病毒接种组均未出现明显的肺部病变。野毒株PCV2 （SH04）和（?）nPCV2组小鼠脾脏均出现了轻度的显微病变,与对照组相比差异显著。但三个杂合型病毒PCV12、PCV2-2NLS1和PCV12-2NLS1接种组小鼠脾脏的病变程度与对照组差异不显著。流式细胞检测结果显示SH04和mPCV2接种后,小鼠外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞含量显著低于其余各组（p<0.05）。但PCV12接种组小鼠外周血T淋巴细胞亚群变化与对照组相比不明显。因此,PCV12在体内的致病性明显低于野毒株SH04和重组PCV2病毒,但与PCV2野毒株具有相似的免疫原性。然而,PCV2-2NLS1和PCV12-2NLS1在体内外都只表现较弱的复制增殖能力,表明将PCV1核衣壳蛋白NLS序列替换PCV2相应部位序列并没有提高PCV2病毒的复制能力。相反地,由于包含PCV1和PCV2 ORF2蛋白核定位信号的N端核衣壳序列的互换可能使杂合型核衣壳蛋白核定位功能减弱或丧失,甚至导致蛋白结构和功能的改变,从而影响病毒的复制和组装。综上所述,本论文对浙江省及其周边地区猪场中PCV2的流行进行了系统的调查,发现PCV2感染呈广泛流行并有明显上升趋势,且其毒株与国内外其它毒株相比在ORF2蛋白的两个主要抗原表位区具有较大差异。同时,我们发现PCV1ORF2蛋白的核定位功能由其N端氨基酸短肽9RRRR12和25RRPYLAHPAFRNRYRWRRK43决定,与PCV2 ORF2蛋白的NLS有较大差异。重组病毒体内外特性研究表明PCV12对小鼠的致病性明显低于野毒株PCV2和mPCV2病毒,但它们却具有相似的复制能力和免疫原性。而PCV2-2NLS1和PCV12-2NLS1病毒在体内外复制能力都较弱,表明将PCV1核衣壳蛋白NLS序列替换PCV2相应部位序列并没有明显提高PCV2病毒的复制能力。提示PCV2-2NLS1和PCV12-2NLS1病毒核衣壳蛋白的核定位元件中可能存在关键碱性氨基酸位点对于病毒复制具有重要影响或致死性的,从而影响了病毒的复制和组装。进一步研究可对PCV1和PCV2核衣壳蛋白不同的核定位元件中的碱性氨基酸位点进行突变,从而在更大程度上保证Cap蛋白的完整性和兼容性,以研究核定位元件在病毒复制中的作用。而本研究中基于质粒的病毒感染性克隆构建方法的建立及成功运用将有助于我们对PCV病毒复制和蛋白功能的进一步研究。而小鼠感染模型也为进一步的研究提供了便利。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 1 猪圆环病毒的一般生物学特征
• 1.1 猪圆环病毒的发现和分类
• 1.2 PCV的形态和理化特性
• 1.3 PCV的体外培养特性
• 2 猪圆环病毒的分子生物学特征
• 2.1 PCV2分子特征和主要元件
• 2.2 PCV2毒株的遗传进化分析
• 3 PCV的复制与转录
• 4 PCV2感染性克隆技术的研究进展及其在疫苗开发中的应用
• 5 PCV2感染及其相关疾病的研究进展
• 5.1 PCV2相关疾病的研究
• 5.2 断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）
• 5.3 PCV2的感染和致病机理
• 5.3.1 PCV2的感染
• 5.3.2 PCV2的致病机理
• 5.4 PCV2的流行病学研究
• 6 PCV2的检测
• 6.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 6.2 免疫组化试验（IHC）
• 6.3 间接免疫荧光（IFA）
• 6.4 PCR技术
• 6.5 核酸杂交技术
• 6.7 限制性长度多态性分析（RFLP）
• 参考文献
• 第二部分 研究内容
• 第一章 浙江省及周边省市PCV2分子流行病学调查及病毒的分离鉴定
• 1.材料与方法
• 1.1 细胞、载体与试剂
• 1.2 病料采集
• 1.3 病毒DNA提取
• 1.4 PCV2特异性检测引物的设计及病料中PCV2的检测
• 1.5 不同地区、不同时间PCV2毒株ORF2的扩增和测序
• 1.5.1 PCR产物纯化
• 1.5.2 连接
• 1.5.3 CaCl2法制备E.coli DH5α感受态细胞
• 1.5.4 转化
• 1.5.5 碱裂解法抽提质粒
• 1.5.6 重组质粒鉴定和测序
• 1.6 PCV2病毒分离
• 1.7 PCV2分离株的PCR和间接免疫荧光（IFA）鉴定
• 1.8 分离毒株全基因组扩增、克隆和测序
• 1.9 病毒纯化及形态观察
• 1.10 序列分析
• 2.结果分析
• 2.1 病理学变化观察
• 2.2 组织病料中PCV2的PCR检测结果
• 2.3 不同地区、不同时间PCV2毒株的ORF2序列分析
• 2.5 PCV2的分离和鉴定
• 2.6 PCV2分离株全基因组序列分析
• 2.7 病毒纯化
• 3.讨论
• 参考文献
• 第二章 浙江省及周边省市PCV2感染的血清学调查
• 1.材料与方法
• 1.1 细胞、载体与试剂
• 1.2 猪血清样品采集
• 1.3 PCV2和PCV1 ORF2蛋白的表达纯化
• 1.4 多抗的制备
• 1.5 融合蛋白Cap2s和Capls免疫反应性分析
• 1.6 IFA鉴定多抗的反应性和特异性
• 1.7 猪血清样品中PCV2抗体ELISA检测方法的建立
• 1.8 浙江省及周边省市猪群PCV2感染的血清流行病学调查
• 2.结果
• 2.1 PCV2 ORF2蛋白和PCV1 ORF2蛋白的表达纯化
• 2.2 纯化蛋白Western blot鉴定
• 2.3 PCV1和PCV2兔多抗特性的IFA鉴定
• 2.4 PCV2抗体ELISA检测方法的建立
• 2.5 浙江省及周边省市猪群PCV2血清流行病学调查
• 3.讨论
• 参考文献
• 第三章 猪圆环病毒1型ORF2蛋白核定位信号原件的定位
• 1.材料与方法
• 1.1 载体与试剂
• 1.2 细胞及病毒
• 1.3 病毒DNA抽提
• 1.4 重组真核表达质粒的构建
• 1.5 PCR扩增产物的磷酸化处理
• 1.6 转染级别超纯质粒的抽提
• 1.7 细胞转染及荧光观察
• 1.8 各融合基因在转染细胞内的转录分析
• 2.结果分析
• 2.1 重组表达质粒的构建及转染级别质粒的抽提
• 2.2 IFA鉴定PCV1感染细胞中病毒核衣壳蛋白的定位
• 2.3 PCV1 ORF2及其截断序列与EGFP融合表达产物的细胞定位
• 2.4 PCV1 ORF2蛋白中核定位信号元件的分析和确定
• 3.讨论
• 参考文献
• 第四章 PCV1、PCV2及其突变体感染性克隆的构建和体外复制能力研究
• 1.材料与方法
• 1.1 细胞和病毒
• 1.2 工具酶和试剂
• 1.3 引物设计和感染性克隆的构建
• 1.4 高纯质粒抽提和细胞转染及检测
• 1.5 体外感染稳定性实验和TCID50测定
• 1.6 体外复制能力比较试验
• 1.7 Real-time PCR体系的建立
• 2.结果
• 2.1 感染性克隆的构建和鉴定
• 2.2 Real-time PCR体系的建立
• 2.3 各感染性克隆转染PK-15细胞后能形成具有感染性的病毒粒子
• 2.4 重组病毒体外感染稳定性实验
• 2.5 各感染性克隆体外生长能力比较
• 3.讨论
• 参考文献
• 第五章 重组病毒对BALB/C小鼠的致病性和免疫原性比较
• 1. 材料与方法
• 1.1 细胞、病毒、动物和试剂
• 1.2 重组病毒体外传代和增殖
• 1.3 试验设计和攻毒
• 1.4 病理学与组织病理学观察
• 1.5 病毒血症的检测
• 1.6 血清学鉴定及其抗体消长规律分析
• +、CD4⁺、CD8⁺亚群分析'>1.7 小鼠外周血林把细胞CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺亚群分析
• 2.结果
• 2.1 试验小鼠的组织病理学观察
• 2.2 小鼠体内病毒特异性抗体的血清学分析
• 2.3 病毒血症检测
• +、CD8⁺T淋巴细胞亚群测定'>2.4 小鼠外周血CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞亚群测定
• 3.讨论
• 参考文献
• 结论与展望
• 攻读博士学位期间发表的学术论文
• 致谢