论文摘要
土壤盐渍化抑制作物生长,降低农产品产量,是影响农业生产和生态环境的严重问题,而且土壤盐渍化的耕地面积正逐年增加。植物的耐盐性又是一个复杂的数量性状,涉及诸多基因和多种耐盐机制的协调作用,具体作用机制仍未阐明。因此,研究植物耐盐相关基因的功能具有重要意义,不仅有利于植物耐盐分子机制具体作用途径的明确;而且有利于基因工程有效地提高转基因作物的耐盐性。本研究对罗布麻DEAD-box解旋酶的基因（AvDH1）的表达特性进行了分析,对AvDH1转化棉花新品系鲁613获得的转化株系进行了耐盐性鉴定,获得主要结果如下:1.非生物胁迫下罗布麻中AvDH1基因的表达:Northern杂交分析表明,AvDH1基因受盐胁迫诱导表达,而且其mRNA的含量随着盐浓度的增加而增加;在盐胁迫下该基因在罗布麻的根、茎及叶片各组织中组成型表达;这些说明在盐胁迫下AvDH1基因对于维持细胞基本功能可能具有重要作用。在罗布麻的根、茎及叶片各组织中该基因也受低温胁迫诱导表达,但是其表达量随着时间的延长逐渐降低,而在渗透胁迫处理下AvDH1基因不表达,这说明AvDH1基因为盐诱导特异表达基因。在外施脱落酸的处理下该基因也不表达,这说明该基因受到不依赖于脱落酸的盐胁迫信号转导途径的调节。2.利用花粉管通道技术将AvDH1基因导入鲁613棉花中,获得的种子在含盐量为0.5%的盐池进行筛选,获得4个耐盐单株,对耐盐单株自交形成的株系进行卡那霉素田间筛选,株系T40252全为阳性表现,这说明其基因型为纯合型,株系T42047和T40224卡那霉素抗性植株与非抗性植株的比例接近3:1,经标准误差法检验,这两个株系的观察值和理论值之间相符,符合孟德尔一对显性遗传性状的分离规律,这说明其基因型为杂合型;而T41705全为阴性表现,这说明其可能为假阳性植株。对选至分离株系的抗性植株进行自交,通过T3抗感单株的分离比例分析,进一步验证了杂合型符合3:1的孟德尔一对显性遗传性状的分离规律。从3个株系中随机选择的抗性植株进行特异PCR扩增检测,抗性单株均扩增出大约225bp的目的片段,这与阳性质粒扩增片段大小相同,而受体鲁613对照无此片断。进行PCR-Southern杂交分析,转基因株系检出片断与阳性质粒检出片断相同,而受体鲁613对照无片断检出,此结果与PCR检测结果一致,分子杂交结果表明AvDH1基因已经整合入受体棉花鲁613的基因组中,并且稳定的遗传。3.选择T2代株系中分子杂交表现为阳性的单株和受体鲁613的单株,在盐胁迫条件下,进行花粉萌发鉴定,结果表明在盐胁迫下转基因株系的花粉萌发率高于受体,差异达到极显著水平;对转基因单株和受体倒四叶,进行叶片耐盐鉴定,结果表明,在150mmol/L的NaCl浓度下,受体鲁613的叶片变黄,叶绿素含量下降了24.3%,而T42047、T40252和T40224的表现趋于一致,仅下降了约5%,显著高于对照;其中转基因株系T40252在300mmol/L的NaCl浓度下,叶片才开始变黄,这表明转基因棉花叶片的耐盐性高于对照。4.选择T3代稳定纯合的株系,进行盆栽耐盐性鉴定,结果表明在在300mmol/L的NaCl浓度下,转基因株系的生长虽然受到一定程度的影响,但是,仍然保持存活,而受体鲁613种子不能萌发或者生长过程中萎蔫死亡;在100mmol/L与200mmol/L各转基因株系株高与存活率均显著高于对照。对盐胁迫转基因株系受体鲁613的SOD酶活性变化分析表明,在100mmol/L的NaCl浓度下,各株系SOD酶的比活与对照表现趋于一致,均有大幅上升。在200mmol/L的NaCl浓度下,鲁613子叶SOD酶的活性仅略有上升,而T42047、T40252和T40224子叶SOD酶的活性表现趋于一致,增长了约30%,明显高于对照;在100、200mmol/L的NaCl胁迫下,转基因株系T42047、T40252和T40224的相对电导率均显著低于受体鲁613。以上结果表明三个转AvDH1基因棉花纯合株系的耐盐性显著提高。5.核酸序列的预测分析表明:AvDH1基因所编码的氨基酸序列与拟南芥中一个DEAD-box解旋酶的序列高度同源,具有73%的一致性,共447个氨基酸残基组成,预测的分子量为50478Da,等电点为7.61。AvDH1基因的翻译产物具有DEAD-box家族所有的9个保守基序,位于氨基酸序列的第33-365个之间。其SAT基序为Thr-Ala-Thr,与其它DEAD-box家族不同;在羧基末端,即氨基酸序列中第365-447之间,存在两个参与RNA结合的RGG-box基序,还具有细胞核定位信号序列,KKSRKEKK。