重组藻红蛋白的表达及活性研究和链状亚历山大藻钙调蛋白基因的克隆及表达分析

论文摘要

藻红蛋白是红藻中重要的捕光色素蛋白,对藻体正常的生长具有重要作用。近年来,其潜在的生物活性引起了广泛的重视,如作为光敏剂由于杀伤肿瘤细胞的研究;在体外的抗氧化活性,提高机体免疫力等医药和保健方面的作用。本实验的目的是通过基因工程的方法获得重组的藻红蛋白,并研究它的抗肿瘤和抗氧化活性。本实验将含有藻红蛋白PE基因的重组质粒pGEX-PE在大肠杆菌中诱导表达。表达产物进行SDS丙烯酰胺凝胶电泳和Western-blotting检测,表明藻红蛋白在大肠杆菌中得到了表达,并且大部分以包涵体的形式存在。经大量培养收集菌体和超声波破碎细胞,可溶性上清用来做活性分析。肿瘤抑制试验结果表明含有藻红蛋白的重组菌的表达产物对肿瘤细胞的生长具有抑制作用,并且随着浓度的增加抑制率从37.31%上升到63.26%。两个含有藻红蛋白基因的重组质粒pBGL和pGEX-PE的表达产物用于清除自由基实验。在清除自由基的实验中,我们采用了超声波和加热破碎菌体细胞,来研究两种处理下可溶性上清的抗氧化活性。利用Fenton反应产生的羟自由基能与水杨酸生成羟基化产物2,3-二羟基苯甲酸的原理,用比色法测定羟自由基的生成量,测得含pBGL与pGEX-PE菌体表达产物对于·OH的清除率明显高于空载体,其清除率分别达到61.12%和65.76%,证明藻红蛋白对·OH具有明显的清除作用;加热破碎菌体的方法使蛋白发生了部分变性,影响了藻红蛋白清除自由基活性,但仍有该生物活性。本研究结果表明通过基因工程的方法得到的藻红蛋白具有抑制肿瘤生长和清除自由基的生物活性。赤潮是全球性的主要海洋灾害之一,对赤潮爆发的分子和遗传机理研究,有利于更好的监测预报其发生。链状亚历山大藻（Alexandrium catenella）作为一种重要的赤潮甲藻,利用分子生物学的手段研究其细胞周期及信号转导机制,能够进一步阐明其种群爆发生长的机制,这对于了解赤潮动力学及应用于赤潮预报和防治具有重要意义。钙信号传导系统广泛存在真核细胞中,并在各种细胞活动如胁迫反应、细胞增殖中发挥重要作用。钙调蛋白（calmodulin,CaM）和CaM相关蛋白是细胞内主要的Ca2+受体,在Ca2+所介导的各种细胞反应过程中充当中间媒介,参与调节细胞的增殖、分化等基本的代谢过程。我们根据NCBI数据库中相近物种的钙调蛋白序列设计简并引物,提取纯化培养的链状亚历山大藻（Alexandrium catenella）细胞RNA,反转录为cDNA,利用RT-PCR方法获得cam基因部分序列,测序,鉴定。根据已得序列,设计引物,采用RACE的方法获得3’端序列,拼接后获得了464bp的cam的部分cDNA序列,其中3’端非翻译区为106bp,并且没有发现明显的加尾信号。将得到的钙调蛋白部分cDNA序列,参照其他物种的开放阅读框架,翻译成蛋白质,共编码102个氨基酸,与其他物种的钙调蛋白这部分序列的比对结果表明具有很高的相似性,与列举的其他四种甲藻的相似性为98%,与高等植物拟南芥、大麦、玉米等的相似性高达91%,与果蝇、鼠、人的相似性为86%,而与衣藻的相似性为84%。保守功能域及二级结构分析表明链状亚历山大藻的钙调蛋白这部分序列具有保守的EFh功能域、3个Ca2+的结合位点和6段螺旋结构。实时荧光定量PCR的方法分析了钙调蛋白基因cam在A.catenella不同生长时期的表达变化,以△△Ct法来处理数据,表示目的基因的表达相对改变量。结果表明,在细胞进入明显的指数增长期（第10天）时,cam的表达明显上调;而在细胞增长进入停滞期/衰亡期时（第26天后）,cam的表达明显下调;说明cam的表达与其增长率的变化具有一致性。而在细胞处于指数增长期阶段,cam的表达也存在变化,推测钙调蛋白在亚历山大藻细胞对营养盐变化的响应及孢囊形成起作用。对A.catenella的钙调蛋白基因的研究,能够为进一步阐明钙信号传导系统在甲藻生活史中的作用机理奠定基础。

论文目录

摘要

Abstract

第一章重组藻红蛋白的表达及活性研究

第一节藻红蛋白研究进展

1. 藻红蛋白的基本性质

2. 藻红蛋白在藻体生理过程的作用

3. 藻红蛋白的应用

第二节课题的目标和意义

第三节重组藻红蛋白的表达及活性研究

0. 前言

1. 材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

5. 小结

参考文献

第二章链状亚历山大藻钙调蛋白基因的克隆及表达分析

第一节文献综述

1. 赤潮及其危害

2. 甲藻与赤潮及其基本特征

3. 分子生物学技术在赤潮研究中的应用

4. 钙调蛋白研究进展