论文摘要
目的脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,占颅内肿瘤的35.12%～61.10%。目前临床治疗胶质瘤的方法主要是手术治疗、放疗、化疗,近几十年来,尽管新的诊疗技术不断出现,但由于大多数胶质瘤呈浸润性生长,与周围脑组织边界不清,治疗效果不佳,病人的总体生存率没有明显改进。分子生物学研究的不断深入,为神经胶质细胞瘤的基因治疗提供了广阔前景,近些年来,人们越来越多地把目光投向胶质瘤的基因治疗。因此,寻找可用于神经胶质细胞瘤治疗的靶基因对神经胶质细胞瘤的治疗有重要价值。PDCD4（programed cell death 4）是近年来新发现的抑癌基因,能够通过抑制蛋白转录和翻译过程抑制肿瘤细胞的生长。那么PDCD4在人神经胶质瘤组织中的表达状况如何?影响PDCD4表达的因素有哪些?在神经胶质细胞瘤转归中的作用是什么?能否成为神经胶质细胞瘤基因治疗的靶基因?是非常值得探索的问题。为了明确PDCD4与人神经胶质细胞瘤发生、发展的关系,进一步以PDCD4为靶点进行基因治疗提供实验依据,本论文从以下三个方面进行了研究:1.PDCD4在人神经胶质瘤中的表达状态及其临床意义;2.PDCD4 5’CpG岛甲基化与胶质瘤PDCD4mRNA缺失的关系;3.外源性PDCD4在神经胶质瘤细胞系的表达及其对胶质瘤细胞生长、凋亡和克隆形成的影响。方法一、PDCD4在人神经胶质瘤中的表达状态及其临床意义1.病例的收集:收集山东大学齐鲁医院神经外科2003-2006年神经胶质瘤患者的新鲜手术标本总共30例包括其中3例相应患者的癌旁组织,以及石蜡包埋的肿瘤标本61例。所有患者术前未接受任何放、化疗治疗。2.分别用RT-PCR、Western blot和免疫组化方法检测神经胶质瘤细胞系U251、U87以及肿瘤组织中PDCD4 mRNA和蛋白的表达情况。3.x2检验分析PDCD4在不同胶质瘤病例中的表达与胶质瘤临床病理特点间的关系。Kaplan-Meier生存曲线以及Cox多因素回归分析PDCD4在不同胶质瘤病例中的表达与胶质瘤患者生存率之间的关系。二、PDCD4 5’CpG岛高频甲基化与胶质瘤PDCD4mRNA缺失的关系1.PDCD4 5’CpG岛甲基化的检测:从肿瘤组织以及胶质瘤细胞系中提取基因组DNA,用重亚硫酸盐修饰基因组DNA,用甲基化特异性PCR（MSP）的方法检测胶质瘤细胞系以及肿瘤标本中PDCD4甲基化的情况。2.去甲基化处理后对PDCD4表达的影响:通过去甲基化药物5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）处理胶质瘤细胞系,利用甲基化特异性PCR（MSP）的方法检测PDCD4的甲基化情况;利用RT-PCR、Western blot以及细胞免疫化学观察PDCD4的恢复表达情况。3.采用Pearson’s相关系数分析PDCD45’CpG岛甲基化与胶质瘤PDCD4mRNA缺失的关系。三、外源性PDCD4在神经胶质瘤细胞系的表达及其对细胞生长、凋亡和克隆形成的影响1.用空载体或PDCD4重组表达载体转染胶质瘤细胞系,利用RT-PCR和Westernblot方法检测PDCD4在转染后人神经胶质瘤细胞系中的表达,分别建立PDCD4表达与缺失的肿瘤细胞模型。2.倒置显微镜观察PDCD4在转染前后人神经胶质瘤细胞系生长、分化的形态学变化。3.流式细胞术分析PDCD4转染后人神经胶质瘤细胞系凋亡与细胞周期的变化情况。4.克隆形成实验观察PDCD4转染后人神经胶质瘤细胞系集落形成程度的变化情况结果一、PDCD4在人神经胶质瘤中的表达状态及其临床意义（一）PDCD4在人胶质瘤细胞系中的缺失为了研究PDCD4在神经胶质细胞瘤中的作用,我们首先用RT-PCR和Western blot的方法检测了PDCD4在神经胶质瘤细胞系U251、U87中的表达,结果发现这两株细胞系中PDCD4mRNA和蛋白的表达均缺失,提示PDCD4可能在神经胶质细胞瘤中发挥作用。（二）PDCD4在人原发神经胶质瘤标本中的低表达或缺失为了进一研究PDCD4在神经胶质细胞瘤中的作用,我们采用RT-PCR和Western blot的方法检测了PDCD4在30例新鲜的原发神经肿瘤组织和3例神经胶质瘤癌旁组织中的表达,同时用免疫组织化学的方法分析了PDCD4在91例神经胶质细胞瘤中的表达部位和表达状态。结果显示癌组织表达高水平的PDCD4,而30例新鲜胶质瘤组织中有14例标本缺乏PDCD4 mRNA表达,缺失率为47%（14/30）,在剩余的16例肿瘤组织标本中,与癌旁组织表达相比有12例标本（40%,12/30）出现了不同程度的表达降低。Western blot的检测结果发现PDCD4蛋白在胶质瘤中缺失高于PDCD4 mRNA的缺失,在30例神经胶质瘤组织标本中PDCD4蛋白的缺失率达77%（23/30）,也就是说有的肿瘤组织尽管表达PDCD4 mRNA,但PDCD4蛋白的表达则缺失。另外,表达PDCD4的7例标本中有6例PDCD4的表达较癌旁组织明显降低。为了进一步证实PDCD4在胶质瘤的高频缺失状况,为分析PDCD4表达与病人临床病理特征和预后的关系奠定基础,我们又用免疫组织细胞化学的方法检测PDCD4在91例神经胶质细胞瘤中的表达,结果与Western blot的相似,癌旁组织表达高水平的PDCD4蛋白,而82%（75/91）神经胶质细胞瘤中缺乏PDCD4蛋白的表达。（三）PDCD4表达缺失与胶质瘤临床病理特征和预后之间的相关性为了阐明和了解PDCD4在神经胶质瘤发生、发展中的作用,我们详细分析了PDCD4表达缺失与神经胶质瘤临床病理特点间的关系,结果显示PDCD4表达与神经胶质瘤患者的年龄、组织学分型、病理学分级均无明显相关性。然而,利用Kaplan-Meier生存曲线分析和经生存率分布Log-rank检验发现,尽管在低级别（Ⅰ-Ⅱ级）的胶质瘤标本中,PDCD4表达高的肿瘤患者预后与PDCD4表达低的肿瘤患者相比,无显著性差异（p＞0.05）;但是在高级别（Ⅲ-Ⅳ级）的胶质瘤标本中,PDCD4表达高的肿瘤患者预后明显好于PDCD4表达低的肿瘤患者（p=0.0013）。进一步经过COX多因素回归分析发现,PDCD4表达对于胶质瘤患者的生存是独立的预后因素（相对危险系数,0.063;95%可信区间,0.014-0.276,p＜0.0001）。说明在高级别胶质瘤患者PDCD4表达改善了预后,延长了患者的生存时间,是反映患者预后好转的重要预测因素。通过临床追踪调查发现和COX多因素回归分析发现,PDCD4表达是胶质瘤患者的独立的预测因素（relative risk,0.063;95%confidence interval,0.014-0.276,p＜0.0001）。在高级别（Ⅲ-Ⅳ级）的神经胶质瘤患者中,PDCD4表达与神经胶质瘤患者预后具有明显相关性（p=0.0013＜0.01）,PDCD4表达的患者其生存率要高于PDCD4表达缺失的患者,在低级别（Ⅰ-Ⅱ级）神经胶质瘤患者中,PDCD4表达与神经胶质瘤患者预后无明显的相关性（p＞0.05）。另外,我们注意到PDCD4的表达缺失与患者的性别具有相关性（p=0.0245＜0.05）,男性患者缺失率高于女性患者。二、PDCD4 5’CpG岛甲基化与胶质瘤PDCD4mRNA缺失的关系上述结果提示PDCD4在神经胶质细胞瘤中存在高频缺失。已有报道PDCD4在肺癌、胰腺癌和肝癌中也均存在表达缺失,但到目前为止PDCD4表达缺失的原因尚未见报道。因此我们在上述研究的基础上,从表观遗传学水平出发,分析了PDCD4 5’CpG岛的甲基化状态以及与胶质瘤PDCD4mRNA缺失的关系。1.在PDCD4表达缺失的胶质瘤细胞系中发现PDCD4 5’CpG岛存在甲基化为寻找PDCD4在人神经胶质瘤表达缺失的原因,我们首先分析了胶质瘤细胞系中PDCD4调控序列的甲基化状况,通过MSP和基因序列分析发现PDCD4缺失的神经胶质瘤细胞系U251、U87中均有PDCD45’CpG岛不完全甲基化的存在,而在PDCD4表达正常的癌旁组织中未发现5’CpG岛甲基化的存在。2.在原发性胶质瘤中发现PDCD4 5’CpG岛存在甲基化进一步分析原发性胶质瘤中PDCD4调控序列的甲基化状况,我们用MSP方法检测了30例原发性神经胶质瘤和3例癌旁组织中PDCD4 5’CpG岛的甲基化状态,并通过T-A克隆和基因测序的方法对部分标本的甲基化位点进行了测定。结果显示3例癌旁组织PDCD4均无甲基化,但47%（14/30）原发性胶质瘤存在甲基化,其中5例为完全甲基化,9例为不完全甲基化。3.PDCD4 5’CpG岛的甲基化与胶质瘤PDCD4mRNA表达缺失密切相关用SPSS13.0统计学软件分析了PDCD45’CpG岛甲基化与PDCD4mRNA表达之间的关系,结果显示PDCD4mRNA表达缺失与PDCD45’CpG岛发生甲基化存在着非常强的负相关性（Pearson相关系数r=-1.000,p＜0.0001）。PDCD4 mRNA表达的癌旁组织和肿瘤组织均无甲基化,而不表达PDCD4mRNA的胶质瘤细胞系和癌组织均检测到PDCD45’CpG岛的甲基化。4.去甲基化药物处理不表达PDCD4的胶质瘤细胞系可恢复PDCD4表达对细胞系和临床标本的检测显示PDCD4 5’CpG岛的甲基化与胶质瘤PDCD4mRNA表达缺失密切相关,为了进一步证实这种观点,我们应用不同浓度的去甲基化药物5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）处理胶质瘤细胞系U251以及U87。通过MSP发现随着甲基化药物浓度的不断增高,胶质瘤细胞系U251、U87其PDCD4启动子区CpG岛的甲基化程度也逐渐降低。通过RT-PCR、Westernblot以及细胞免疫化学发现随着甲基化药物浓度的不断增高,胶质瘤细胞系U251、U87中PDCD4表达被不断上调,说明去甲基化可以恢复PDCD4的表达。从另一个侧面说明PDCD4 CpG岛的甲基化是胶质瘤细胞缺失PDCD4表达的主要原因之一。三、外源性PDCD4在神经胶质瘤细胞系的表达及其对细胞生长、凋亡和克隆形成的影响为了进一步确定PDCD4在神经胶质瘤发生中的作用和为临床治疗提供实验依据,我们通过转染技术使外源性PDCD4在神经胶质瘤细胞系中表达并研究了外源性PDCD4对肿瘤细胞生长、凋亡、细胞周期和克隆形成的影响。1.外源性PDCD4表达能够明显抑制胶质瘤细胞的生长我们分别将空载体以及PDCD4重组表达载体体外瞬时转染PDCD4缺失的恶性神经胶质瘤细胞系-U251,48小时后,PDCD4表达载体转染的细胞生长较空载体转染细胞的生长明显被抑制（p＜0.05）,而且细胞出现向正常胶质细胞再分化的趋势。2.外源性PDCD4的表达显示PDCD4能够明显抑制胶质瘤细胞的克隆形成能力克隆形成能力是肿瘤恶性程度的重要标志,通过克隆形成实验进一步发现:PDCD4表达载体转染的U251细胞克隆形成抑制率为86.47%±1.10,与对照组比较差异显著（p＜0.01）;同样,PDCD4表达载体转染的U87细胞克隆形成抑制率为32.68%±0.34,与对照组比较差异显著（p＜0.01）。3.外源性PDCD4表达对细胞周期的影响为了探讨PDCD4抑制肿瘤生长的机制,我们用流式细胞术分析了PDCD4表达对细胞周期的影响。细胞经PI染色后,流式细胞术检测显示表达PDCD4的U251（U251-PDCD4）细胞G2/M期细胞比例（6.23%±0.91）较空载体组（10.6%±1.65）或未转染组（12.6%±1.91）明显减少（p＜0.05）,而U251-PDCD4 S期细胞比例（27.9%±1.38）较空载体组（25%±0.96）或未转染组（18.1%±1.25）明显升高,但各组间Go/G1期比例没有明显差异。说明PDCD4的转染干扰了U251细胞的生长周期。4.外源性PDCD4表达对细胞凋亡的影响为了探讨外源性PDCD4表达在细胞凋亡中的作用,我们分别用Annexin V和TUNEL染色法检测了细胞的早期凋亡和晚期凋亡。Annexin V早期凋亡检测试剂染色后,通过流式细胞仪分析发现:PDCD4转染胶质瘤细胞系48h后,细胞凋亡率达12%,较未转染组（0.1%）及空载体转染组（5.3%）细胞凋亡率明显增高（p＜0.05）。TUNEL晚期凋亡检测试剂染色后,通过荧光显微镜分析发现:未转染组及空载体转染组无阳性染色细胞;而PDCD4表达载体转染组细胞发现多数阳性染色细胞,并可见明显的核碎裂、核浓缩现象。通过流式细胞仪分析发现PDCD4载体转染组细胞的凋亡率与未转染组或空载体转染组相比明显升高（p＜0.05）。结论1.PDCD4在人原发性胶质瘤中存在高频缺失;在高级别（Ⅲ-Ⅳ级）的神经胶质瘤患者中,PDCD4表达的缺失与神经胶质瘤患者的不良预后具有明显相关性,而且是胶质瘤患者预后的独立预测因素。2.PDCD4 5’CpG岛的甲基化是胶质瘤PDCD4mRNA表达缺失的直接原因。3.PDCD4在胶质瘤细胞再表达可明显抑制胶质瘤细胞的生长和克隆形成能力,其机制可能是通过干扰细胞的生长周期以及诱导胶质瘤细胞发生凋亡。创新性和意义1.本研究的创新点是在国内外首先发现PDCD4在胶质瘤中的表达出现高频率缺失,而且与病人的预后有关。并在体外实验发现PDCD4可通过干扰细胞生长周期以及诱导细胞凋亡从而抑制胶质瘤细胞的生长,抑制胶质瘤细胞的克隆形成能力。为以PDCD4为靶点进行基因治疗提供了第一手资料。2.证明CpG岛甲基化是PDCD4mRNA在肿瘤细胞表达缺失的原因之一。尽管我们和其他学者报道PDCD4在神经胶质瘤、肺癌和胰腺癌中表达缺失,但对其缺失的原因,尚未见报道。我们从表观遗传学的角度,提供证据证明CpG岛甲基化是PDCD4mRNA在神经胶质瘤细胞表达缺失的主要原因,为探索通过恢复PDCD4表达治疗神经胶质瘤奠定了基础。研究的局限性1.PDCD4能否诱导神经胶质瘤细胞出现再分化及其诱导的具体机制以及潜在的临床应用价值有待进一步研究。2.导致PDCD4在神经胶质瘤中出现高频缺失的其它可能原因尚有待进一步证明。3.PDCD4抑制胶质瘤细胞生长的具体机制和意义尚有待进一步研究。