人乳头瘤病毒16型E2基因的克隆、表达及鉴定

论文摘要

宫颈癌是妇科恶性肿瘤死亡的主要病因。分子生物学研究发现,高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）感染与90%以上的宫颈癌有着密切的联系,进而发现尤其是HPV16型在各地区HPV亚型分布中居于主导地位。高危型人乳头瘤病毒以两种方式途径感染宫颈上皮细胞。在HPV急性感染中,完整病毒DNA游离地存在于宿主细胞,并自主完成生活周期,产生新的感染病毒颗粒。而在少数HPV感染病人身上,病毒环状基因组整合进宿主细胞染色体,导致高级宫颈内皮瘤病变,甚至可能发展为浸润性宫颈癌。感染病毒的早期基因E2丧失功能,E6持续表达在诱发宫颈癌的过程中发挥着重要作用。目前,高危型HPVE2与宫颈癌细胞E6表达和细胞增殖的关系,以及其表达抑制宫颈癌发生发展的机制仍是尚待解决的问题。为了探讨HPV16型E2基因对宫颈癌发展过程的影响,本研究在原核表达系统中诱导表达并纯化E2蛋白,制备抗HPV16E2抗血清。同时,在SiHa细胞中表达外源基因HPV16E2,以鉴定E2蛋白表达对HPV16E6基因表达和SiHa细胞生长状态的影响。研究结果初步表明,E2蛋白能够在大肠杆菌BL21中表达,纯化蛋白在SDS-PAGE电泳上显示单一条带。ELISA和Western blotting检测表明获得的E2抗体具免疫特异性。半定量PCR和细胞计数结果可分别说明,HPV16E2在SiHa细胞中的表达能够抑制内源基因HPV16E6 mRNA表达,并显著降低SiHa细胞的增殖数。由上述实验结果推测,HPV16E2可以结合早期基因启动子,控制人乳头瘤病毒致癌基因的表达,抑制细胞无限增殖,从而对癌症治疗起到一定作用,这为进一步探索宫颈癌的基因治疗方案提供了线索。研究主要包括以下几部分内容:1. HPV16E2基因原核、真核表达载体的构建根据人乳头瘤病毒16E2基因cDNA序列设计一对引物,采用PCR的方法从新疆维吾尔族妇女宫颈癌样本中扩增HPV16E2基因的目的片段并将其插入到原核表达载体pMAL-p2X中。再由构建好的pMAL/HPV16E2重组质粒亚克隆目的基因片段,纯化回收后插入真核表达载体pCDNA3中,构建HPV16 E2基因的真核表达载体pCDNA3/HPV16E2。2. HPV16E2基因原核表达及抗血清的制备为进一步研究HPV16E2基因的功能,将构建好的重组质粒pCDNA3/HPV16E2,免疫小鼠。原核表达重组质粒转化大肠杆菌BL21,加入IPTG诱导表达MBP/E2融合蛋白,表达产物用麦芽糖亲和层析柱纯化。将纯化后的重组蛋白作为检测抗原,ELISA和Western blotting结果表明pCDNA3/HPV16E2免疫小鼠产生了特异性强的抗体。本研究所构建的真核表达载体pCDNA3/HPV16E2及所获得的抗HPV16E2抗体,为在细胞水平上研究HPV16E2基因表达及基因功能提供了有力的工具。3. HPV16E2表达对SiHa细胞生长的影响利用脂质体转染法将真核表达质粒pCDNA3/HPV16E2导入SiHa细胞,表达E2蛋白,观察转染SiHa细胞中HPV16E6 mRNA表达及细胞增殖的情况。RT-PCR和Western blotting结果分别显示E2在SiHa细胞中产生mRNA和蛋白质水平的表达。与转染pCDNA3空载体的对照组比较,转染pCDNA3/HPV16E2组的HPV16E6 mRNA表达明显受到抑制,且SiHa细胞增殖数显著低于对照组（P<0.05）。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略语
• 第一部分 综述
• 第一章 高危型HPV 与宫颈癌研究进展
• 1 HPV 的结构
• 2 HPV 分型及分布
• 3 高危型HPV 的致癌机理
• 3.1 影响HPV 感染的因素
• 3.2 p53 蛋白、pRb 蛋白与E6、E7 蛋白相互作用导致癌变
• 3.3 HPV 感染与端粒酶的激活
• 3.4 性激素引发癌变
• 4 HPV 感染的临床过程
• 5 结语
• 第二章 宫颈癌疾病治疗研究的进展
• 1 HPV 与宫颈癌的检测
• 1.1 巴氏涂片与宫颈癌的检测
• 1.2 HPV 的血清学检测
• 1.3 HPV 的核酸检测
• 2 HPV 治疗研究现状
• 2.1 临床治疗
• 2.2 疫苗
• 2.2.1 基因疫苗
• 2.2.2 病毒样颗粒（VLPs）
• 2.3 其他治疗方式
• 3 结语
• 第二部分 实验与结果
• 第一章 HPV16E2 基因原核表达载体构建及蛋白表达
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株、质粒和试验动物
• 1.2 LB 培养基
• 1.3 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 HPV16E2 基因PCR 扩增的引物设计
• 2.2 HPV16E2 基因的PCR 扩增
• 2.3 HPV16E2 基因克隆载体的构建及序列分析
• 2.3.1 PCR 产物的纯化
• 2.3.2 目的片段与T 载体的连接
• 2.3.3 重组质粒的转化和筛选
• 2.3.4 重组质粒的酶切鉴定
• 2.3.5 测序
• 2.3.6 测序结果分析
• 2.4 质粒和载体的酶切和回收
• 2.5 基因片段HPV16E2 和原核表达载体pMAL-p2X 的连接
• 2.6 重组质粒的转化及鉴定
• 2.7 HPV16E2 基因在大肠杆菌中的表达
• 2.8 E2 融合蛋白在大肠杆菌中的大量诱导表达和纯化
• 3 结果
• 3.1 HPV16E2 基因的克隆
• 3.2 pMAL/HPV16E2 基因原核表达载体的构建及鉴定
• 3.3 目的蛋白的诱导表达及纯化
• 4 讨论
• 第二章 HPV16E2 基因真核表达载体的构建及抗血清制备
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株、质粒和试验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 Western blotting 相关试剂
• 1.4 ELISA 相关试剂
• 2 方法
• 2.1 重组质粒pCDNA3/HPV16E2 构建及在小鼠脏器中的表达
• 2.2 抗血清的制备
• 2.3 Western blotting 检测
• 2.4 抗体水平检测
• 3 结果
• 3.1 HPV16E2 基因在小鼠肝脏中的瞬时表达
• 3.2 抗血清的制备及特异性分析
• 4 讨论
• 第三章 HPV16E2 基因在SiHa 细胞中的表达及分析
• 1 材料
• 1.1 菌株、质粒和试验动物
• 1.2 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 细胞的复苏及培养
• 2.2 细胞传代
• 2.3 质粒转染SiHa 细胞
• 2.4 细胞总RNA 的提取
• 2.4.1 总RNA 的提取
• 2.4.2 消化RNA 中的DNA
• 2.5 反转录PCR
• 2.6 HPV16E2 m RNA 的表达
• 2.7 HPV16E2 蛋白质表达
• 2.8 HPV16E2 对SiHa 细胞的影响
• 2.8.1 HPV16E2 对SiHa 细胞HPV16E6 m RNA 表达的抑制作用
• 2.8.2 HPV16E2 对SiHa 细胞生长的影响
• 3 结果
• 3.1 HPV16E2 m RNA 在SiHa 细胞中的表达
• 3.2 E2 蛋白在SiHa 细胞中的表达
• 3.3 HPV16E2 抑制HPV16E6 mRNA 的表达
• 3.4 SiHa 细胞生长状态的比较
• 3.5 HPV16E2 对SiHa 细胞生长的抑制
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历