拟南芥和生菜维生素C和维生素E的代谢调控

论文摘要

维生素C,又名抗坏血酸（L-Ascorbate acid, AsA）是植物体内主要的抗氧化物质,存在于大多数植物绿色组织中。AsA不仅对于植物自身有非常重要的生理功能,例如抗氧化作用、光合保护以及调节生长发育等,而且植物中的AsA还为不能正常合成AsA的少数动物（包括人类）提供丰富的维生素C源。近来,借助于基因组学和分子生物学技术,维生素C生物合成途径的关键酶基因已在模式生物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中得以确认并克隆,由此廓清了植物维生物C生物合成途径的结构。本文以高等植物拟南芥维生素C生物合成途径关键酶编码基因为基础,通过转基因方法对该途径进行遗传操作,围绕维生素C生物合成途径进行了两个方向的研究。一个方向是以模式生物拟南芥为平台,着力于生物合成途径各位点关键酶基因的细胞定位和对植物AsA含量的贡献。为提升作物维生素C总量提供有效的策略,并在蔬菜作物生菜（Lactuca sativa）中通过过表达和RNAi技术进行初步的验证,同时利用细菌血红蛋白基因调节植物呼吸的手段提高AsA含量；另一方向以双边界植物表达载体和多基因共转化为切入点,研究维生素C和维生素E在生菜中共同提高的能力。定位表达合成途径和再生途径基因的拟南芥转基因系中,AsA含量的HPLC分析结果显示转基因提高了拟南芥中AsA的含量,vtc2转基因株系含量最高提高了3.6倍,比其他各转基因株系的AsA含量的提高更为显著。在这些基因的定位分析中,vtc2可能多分布于内质网膜。vtc4, galdh, galur则均匀的分布于细胞质的各个部分。dhar在靠近细胞膜的地方有较多的分布,可能因为它再生出的AsA有部分直接转移出细胞进入质外体,而gldh的分布可能集中于线粒体。鼠源蛋白gulo也是均匀的分布于细胞质中。生菜中的过表达和RNA干扰株系中,各gme转基因株系中AsA含量最高为14.7mg/100g FW,与对照组相比提高了1.49倍；各dhar转基因株系中AsA含量最高为28.3mg/100g FW,与对照组相比提高了3.8倍;各aoi转基因株系中AsA含量最高为20.1mg/100g FW,与对照组相比提高了2.4倍；各vhb转基因株系中AsA含量最高为23.6mg/100g FW,与对照组相比提高了2.4倍；各thvd转基因株系中AsA含量最高为53.9mg/100g FW,与对照组相比提高了1.9倍；各thvd转基因株系中生育酚含量最高为0.78mg/100g FW,与对照组相比提高了1.8倍；本研究兼顾包括AsA的生物合成,氧化分解和还原再生在内的整个代谢网络,评价了作物多个代谢途径和多个基因的贡献,深入探讨了AsA的代谢工程,得到了AsA和生育酚的含量显著提高的转基因生菜株系,为制定和优化提高植物AsA含量的遗传工程改造策略提供了实验和应用依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 第一章 文献综述
• 1 前言
• 1.1 人工合成
• 1.2 天然提取
• 2 植物AsA合成途径的研究
• 2.1 植物AsA的生物合成途径研究现状
• 2.2 编码植物AsA合成途径中各反应催化酶的基因的克隆和功能
• 3 植物体内AsA的分解代谢和循环再生的研究
• 3.1 植物体内AsA的分解代谢和循环再生途径
• 3.2 植物体内AsA的分解代谢和循环再生途径相关基因的克隆和功能研究
• 4 代谢工程植物提高AsA产量
• 4.1 促进AsA的生物合成
• 4.2 减少AsA的分解
• 4.3 提高AsA的再生
• 4.4 通过促进能量代谢优化AsA代谢合成
• 4.5 多基因安全转化策略
• 5 维生素E代谢研究
• 6 排名第一的蔬菜：生菜
• 7 结论和展望
• 第二章 维生素合成和代谢途径关键酶基因细胞定位
• 1 材料与试剂
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株
• 1.3 常用质粒载体
• 1.4 酶与试剂盒
• 1.5 常用试剂
• 1.6 常用试剂的制备
• 1.7 细菌和植物培养基及培养液
• 1.8 抗生素配制
• 2 实验方法
• 2.1 编码拟南芥Vc代谢途径中酶的基因的获得
• 2.2 目的片段的连接、载体转化和筛选
• 2.3 含有GFP或RFP亚克隆载体的构建
• 2.4 单基因植物定位表达载体的构建
• 2.5 农杆菌培养与转化
• 2.6 拟南芥的种植与转化
• 2.7 转基因拟南芥的分子检测
• 2.8 转基因拟南芥Vc含量的测定
• 2.9 激光共聚焦显微镜观察GOI-GFP表达
• 3 结果与讨论
• 3.1 基因克隆
• 3.2 含有GFP或RFP亚克隆载体的构建
• 3.3 拟南芥Vc合成途径基因植物定位表达载体的构建（以gldh基因的载体构建为例）
• 3.4 转基因植株的分子检测（以转化gldh基因载体的拟南芥为例）
• 3.5 激光共聚焦显微镜观察GOI-GFP表达
• 4 讨论
• 第三章 生菜中维生素C生物合成和代谢途径关键酶编码基因单独作用的评价
• 1 材料与试剂
• 2 实验方法
• 2.1 植物表达载体的构建
• 2.2 农杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.3 生菜的遗传转化方法——叶盘法
• 2.4 转基因生菜的分子检测
• 3 结果
• 3.1 在生菜中过量表达植物维生素C合成途径基因gme
• 3.2 在生菜中过量表达植物维生素C循环途径基因dhar
• 3.3 在生菜中抑制表达植物维生素C代谢途径基因ao
• 3.4 在生菜中过量表达异源血红细胞蛋白基因vhb
• 3.5 边界四价载体：tmt,hpt,vtc2,dhar
• 4 讨论
• 4.1 合成途径关键酶gme
• 4.2 再生途径关键酶dhar
• 4.3 降解途径关键酶AO
• 4.4 细菌血红蛋白基因vhb
• 4.5 四基因双边界载体对生菜维生素含量的改良
• 总结与展望
• 1 研究总结
• 2 特色和创新之处
• 3 后续研究方向
• 参考文献
• 附录
• 1 载体图谱
• 1.1 pHB植物表达载体图谱
• 1.2 pCMABIA1304植物表达载体图谱
• 1.3 pCAMBIA2301植物表达载体图谱
• 2 实验主要仪器设备
• 2.1 常规仪器设备
• 2.2 化学分析相关
• 攻读硕士学位期间发表文章情况
• 致谢