用BRL条件培养基分离克隆鸡胚胎干细胞及诱导分化

论文摘要

胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells,ES cells）是能够进行增殖和自我更新的未分化细胞,具有分化为包括生殖系细胞在内的所有细胞的潜能。鸡的胚胎干细胞（Chicken Embryonic Stem Cells,CES cells）提供了一个研究胚胎早期发育和分化的模型和一种通过对基因组的遗传操作制备转基因鸡（生产治疗性蛋白等）的有效方法。本论文在前人研究的基础上,探讨用大鼠肝细胞条件培养基（BRL-CM）从鸡X期胚盘细胞分离、克隆CES细胞的条件,并对分离到的CES细胞进行多方面鉴定和诱导分化的研究。 实验中将分散的鸡X期胚盘明区细胞（BCs）在小鼠和鸡的成纤维细胞饲养层上培养,24h后出现细胞团块。随后克隆逐渐长大,边缘清晰,呈鸟巢状或葵花状,显微镜观察发现细胞核大,胞质相对较少,核仁明显。分离克隆得到的CES细胞经AKP染色呈阳性,具有分化为多种细胞的能力,用传至2代、3代的ES细胞集落离散后注入海兰白受体,得到了毛色嵌合体鸡。以上表明:BRL-CM可以在成纤维细胞饲养层上从BCs分离克隆CES细胞并能有效抑制CES细胞的分化。 实验中分别收集1d、2d、3d、4d的BRL-CM,制成80%BRL-CM培养CES细胞,结果发现:3dpc收集BRL-CM培养效果最好。BRL-CM可以连续收集多次,分别将第1-9次收集的BRL-CM制成80%BRL-CM培养CES细胞,前5次收集的BRL-CM培养效果最好。ES基础培养基中分别添加体积比0%、10%、15%、20%的FBS制成80%BRL-CM培养CES细胞,结果发现:添加15%FBS培养效果最佳。 实验中分别采用小鼠成纤维细胞系（STO）、小鼠胎儿成纤维细胞（PMEF）和鸡胚成纤维细胞（PCEF）作饲养层及不用饲养层（no feeder）的条件,用BRL-CM培养鸡X期胚盘细胞。结果发现:饲养层与胚盘细胞共培养比不用饲养层更有利于CES细胞克隆的形成（P<0.05）,STO、PMEF比PCEF做饲养层更有利于克隆的形成（P<0.05）,二者均可以作为饲养层支持CES细胞克隆的形成。CES细胞的传代最好采用挑克隆和胰

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1. 引言
• 1.1 胚胎干细胞的研究进展
• 1.2 CES细胞研究进展
• 1.3 维持ES细胞全能性的分子机制
• 1.4 ES细胞的诱导分化
• 1.5 神经细胞的鉴定
• 1.6 影响鸡胚胎干细胞分离培养的因素
• 1.7 条件培养基（CM）在ES分离培养中的应用
• 1.8 CES细胞的鉴定
• 1.9 鸡胚胎的体外培养
• 1.10 本研究的目的、意义及主要内容
• 2. 材料和方法
• 2.1 实验动物
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要设备
• 2.4 有关溶液的配制
• 2.5 主要实验方法
• 2.6 统计分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 CES细胞分离培养
• 3.2 CES细胞的生长特性
• 3.3 CES的诱导分化
• 3.4 鸡胚胎体外培养的研究
• 4. 讨论
• 4.1 CES细胞分离克隆的影响因素
• 4.2 CES细胞的分化潜能
• 4.3 鸡胚胎体外培养
• 5. 结论
• 参考文献
• 图版
• 图版说明
• 致谢
• 个人简介及论文发表情况