Notch信号通路对小鼠小胶质细胞功能的调控作用

论文摘要

神经退行性疾病是威胁人类健康的杀手之一，其患病率随着社会老龄化的进程而日渐升高。帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种常见的神经退行性疾病。在发达国家，60岁以上人群中该病的患病率约为1%。但是对神经退行性疾病的发病原因和机理还知之甚少，目前普遍认为由小胶质细胞介导的神经炎症是这类疾病发生发展的重要机制之一，适当干预小胶质细胞的活化有可能延缓PD等神经退行性疾病的病程进展。小胶质细胞在神经炎症反应过程中表现为不同的极化表型：M1型小胶质细胞促进神经炎症的发生，对神经元产生毒性作用；M2型小胶质细胞则抑制神经炎症的进展，对神经元发挥保护作用。Notch信号通路是与小胶质细胞活化相关的重要信号通路之一。该通路在进化上高度保守，通过局部细胞间相互作用决定细胞命运，是调控胚胎发育和多种成体组织器官体内稳态和细胞分化的重要信号通路。Notch信号通路参与多种免疫细胞的功能调控，如Notch通路参与调控小鼠外周巨噬细胞的抗原呈递功能、活化功能；Notch通路参与调控小胶质细胞对不同刺激的活化反应。目前仅利用原代小胶质细胞和小胶质细胞系MMGT12对小胶质细胞在不同刺激下的极化反应，及Notch通路对该反应的调控作用进行了初步研究；但是这种极化反应及Notch通路对该反应的调控作用在其他小胶质细胞系是否具有可重复性，小胶质细胞的极化表型是否会随微环境的改变而改变，以及Notch通路对小胶质细胞极化反应的调控是否可以持续存在，目前尚不清楚。小胶质细胞系N9是小鼠来源的永生化小胶质细胞，易培养，被广泛用于小胶质细胞的功能研究。目的：（1） N9小胶质细胞是否具有极化现象，这种极化表型是否会随微环境的改变而变化；（2） N9小胶质细胞是否表达Notch通路相关分子；（3） Notch信号通路是否影响N9细胞的体外增殖；（4） Notch信号通路是否参与调控N9细胞的M1/M2型极化，这种调控效应是否具有可持续性。通过研究本课题，以期为神经退行性疾病的防治提供新的诊疗策略。方法：（1）单独应用脂多糖（LPS）或白介素4（IL-4），及联合序贯应用LPS和IL-4刺激N9细胞；采用ELISA检测白介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的分泌量、Griess reagent检测亚硝酸盐的含量、实时定量PCR（q-PCR）法检测N9细胞中各型极化标志分子的表达水平。（2）采用q-PCR法检测N9细胞中Notch通路相关分子的表达水平。（3）将N9细胞分为空白对照组、二甲基亚枫（DMSO）孵育组和γ-分泌酶抑制剂（GSI）孵育组；采用MTT法测定N9细胞的生长曲线。（4）使用GSI持续孵育，或孵育特定时间后停止一段时间，再分别用LPS/IL4刺激N9细胞；采用ELISA检测IL-6和TNF-α的分泌量、Griessreagent检测亚硝酸盐的含量、q-PCR法检测N9细胞中各型极化标志分子的表达水平。结果：（1） LPS刺激组M1型标志分子IL-6、TNF-α、一氧化氮（NO）及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达上调，IL-4刺激组M2型标志分子Arg、Ym1、CCR2及Mmr表达上调；当N9细胞先被LPS刺激、中途撤掉LPS后再被IL4刺激时，IL-6、TNF-α和NO依然高表达，而Ym1和CCR2则表达受抑制；反之，先用IL4刺激后换成LPS刺激时，仍然表现为N9细胞高表达IL-6、TNF-α和NO，而对Ym1和CCR2表达抑制。（2） N9细胞表达Notch受体（Notch1），配体（Jagged2、Dll-1、Dll-4）及下游分子（Hes1、Hes5）。（3） GSI处理组与对照组相比，N9细胞的增殖能力无明显变化。（4）与对照组相比，GSI处理组中IL-6、TNF-α、NO及iNOS的表达显著下降，Arg、Ym1、CCR2及Mmr的表达明显上调；撤销GSI后，TNF-α、IL-6及NO的表达仍低于对照组，而Arg和Ym1的表达仍高于对照组。结论：（1）小胶质细胞的极化现象可能具有普遍性，LPS诱导的M1表型可能被保留，而IL-4诱导的M2表型可能随微环境的变化而变化。（2）小胶质细胞表达Notch通路相关分子，且Notch信号不参与调控N9小胶质细胞的体外增殖。（3） Notch信号通路参与调控小胶质细胞的极化，Notch通路缺失对小胶质细胞极化的调控效应有可能因被“记忆”而持续存在。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 第一部分 N9小胶质细胞的极化现象
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二部分 NOTC H信号通路对N9 细胞增殖能力的调控
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三部分 NOTCH信号通路对N9 细胞极化功能的调控
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢