论文摘要
围产期缺氧缺血（hypoxia ischemia,HI）是造成新生儿脑损伤的首要原因。尤其在早产儿形成一种区别于足月儿和成年人的独特病变---选择性脑白质损伤。病理改变包括脑室周围白质软化（periventricular leukomalacia,PVL）和弥散性脑室周围白质损伤（periventricular white matter injury,PWMI）。后者发生率为前者10倍,以髓鞘减少或髓鞘形成延迟为主要病理特征。近年来,随着新生儿救护技术的提高,早产儿存活率显著增加,PWMI及由此产生的远期神经学后遗症发生率明显上升,给家庭和社会造成巨大负担。少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cells,OPCs）损伤是PWMI形成的主要原因和中心环节。未成熟脑白质中对缺氧缺血高度敏感的OPCs的大量死亡以及分化发育障碍是PWMI形成的关键。因此,深入研究OPCs缺氧缺血性损伤机制,是阐明早产儿脑白质损伤机理,寻找预防和治疗药物,降低早产儿死亡率和致残率的重要途径。迄今为止,对OPCs缺氧缺血损伤机制所知有限,可能与谷氨酸兴奋毒性、炎症介质、氧化应激、细胞内Ca2+超载等多种因素有关。然而针对这些机制的干预措施并未转化为临床治疗成果。ATP是一种重要的神经递质,通过激活嘌呤能受体P2X和P2Y发挥多种作用。P2X7R是嘌呤能受体P2X家族中非常独特的一个亚类,为双功能受体,主要在病理条件下活化。现有的研究表明,P2X7R在胶质细胞具有广泛多样的效应,对病理状态下多个信号通路具有关键的调节作用,提示P2X7R可能处于神经胶质信号过程中相当上游的调节位点,通过调节递质释放、炎症反应、细胞凋亡和增殖,在胶质变性及随后的修复过程中起重要作用。被认为是缺血再灌注损伤,Alzheimer’s病,脊髓损伤和神经性疼痛等疾病潜在的治疗靶点。对于P2X7R在神经胶质病理中的作用,至今还有许多未涉足的领域。新近报道P2X7R拮抗剂能改善疾病模型中的O4+少突胶质细胞凋亡和脱髓鞘病变,提示P2X7R在少突胶质系细胞损伤过程中可能具有重要作用。然而目前对于P2X7R与OPCs的关系尚所知甚少。在预实验中我们发现,离体培养的OPCs呈P2X7R免疫阳性。那么,OPCs表达的P2X7R是否具有功能?受体活化产生什么样的生物学效应?是否参与OPCs缺氧缺血性损害或防御过程?为解决这些问题,首先,我们在原代纯培养的OPCs上检测P2X7R表达和功能效应;其次,观测氧葡萄糖剥夺后P2X7R在OPCs表达的变化以及激动剂、拮抗剂对OPCs缺氧缺血性损伤的干预效应;第三,为在更完整的系统中了解受体表达,建立P3大鼠缺氧缺血性脑损伤模型,观察P2X7R在正常未成熟脑组织不同脑区的表达及HI后的变化。得出如下结果:一、少突胶质前体细胞的培养和鉴定1.混合胶质细胞的培养采用机械分离法;以振荡分离法和差速贴壁法分离纯化OPCs;加入促进神经细胞存活的营养因子N2及促进增殖的细胞因子PDGFα和bFGF,获得数量较多的OPCs,通过NG2鉴定,培养细胞纯度在90%以上,并且具有向成熟少突胶质细胞分化的潜能。OPCs分离纯化的完成为以OPCs为研究对象的实验提供基础和保障。2.采用膜片钳技术证明OPCs具有独特电生理特性:输入阻抗（Ra）相对较高;电压依赖的K+电流具有外向整流特性;对TTX敏感的小的内向Na+流,不能产生动作电位。电生理特性测定也是对OPCs进行鉴定的可靠方法之一。二、P2X7R在少突胶质前体细胞的表达以及受体活化后的功能效应1.通过RT-PCR、Western blot和免疫荧光双标技术,从基因和蛋白水平证明离体培养的OPCs表达P2X7R;2. 100μM BzATP诱导[Ca2+]i显著升高,药理学特性与P2X7R符合:用含EGTA的无钙溶液可以显著降低钙反应振幅,提示[Ca2+]i升高依赖于细胞外Ca2+,该效应由P2X受体介导;BzATP （100μM）诱导的钙信号平均振幅显著高于ATP（100μM）;100nM BBG预处理几乎完全抑制BzATP诱导的钙反应。说明在激动剂刺激下,P2X7R活化介导Ca2+内流,使得[Ca2+]i升高。3.染料负载实验中,300μM BzATP刺激,OPCs的荧光光密度较对照明显增加,300nM BBG预孵育可显著抑制此效应。提示高浓度BzATP诱导离体培养OPCs形成高通透性的质膜孔道,这一过程由P2X7R介导。4. BzATP（100μM）刺激后,OPCs培养基中LDH释放量显著升高,提示BzATP对OPCs具有细胞毒性效应,造成急性细胞损伤。BBG（100 nM）预孵育明显抑制BzATP引起的LDH释放量升高,提示BBG可以明显减轻BzATP的细胞毒性效应,增加细胞存活。三、P2X7R在少突胶质前体细胞缺氧缺血性损伤中作用的初步研究1. OGD后2 h,近40% OPCs死亡。OGD前预先给予BBG（100nM）起到部分保护作用;OGD条件下,BzATP加重OPCs缺氧缺血性损伤,并且这种增强的毒性作用不能被BBG拮抗。提示OPCs对HI十分敏感;P2X7R特异性浓度的BBG对OPCs缺氧缺血性损伤具有部分保护效应,提示P2X7R活化参与OGD造成的OPCs损害;2. RT-PCR和Western blot显示,OGD后2h,P2X7RmRNA和蛋白表达迅速下调,从另一个角度提示P2X7R可能在OPCs缺氧缺血性损害过程中发挥作用。四、P2X7R在新生大鼠脑组织的表达及在缺氧缺血性脑损伤后的变化1. Western blot分析显示,由P0P28,大鼠海马、皮层、白质P2X7R蛋白表达呈上升趋势。2.通过RT-PCR、Western blot分析,从基因和蛋白水平证明P3大鼠海马、皮层、白质表达P2X7R;免疫荧光双标技术显示在海马、皮层和白质,部分NG2+OPCs表达P2X7R;同时,皮层、海马有大量P2X7R免疫阳性神经元,主要表达于细胞胞体。3. P3大鼠单侧颈总动脉结扎,吸入8%氧2h建立缺氧缺血性脑损伤模型,HI后2h,患侧海马、皮层和白质P2X7R免疫反应均减弱,P2X7RmRNA和蛋白水平迅速下调;胼胝体NG2+/P2X7R+细胞数量减少。HI后P2X7R表达下调,提示P2X7R可能参与未成熟脑组织缺氧缺血性损伤过程,但其具体作用和机制尚有待于进一步研究。本实验首先建立离体纯培养OPCs模型,证明OPCs表达功能性P2X7R,受体活化介导Ca2+内流,质膜孔道形成和OPCs死亡。离体培养的OPCs对OGD高度易损,P2X7R拮抗剂BBG能明显减轻OPCs缺氧缺血性损伤。缺氧缺血后早期,离体培养的OPCs、缺氧缺血性脑损伤模型大鼠患侧大脑皮层、皮质下白质和海马P2X7R表达均出现下调。这些结果提示P2X7R参与缺氧缺血性脑白质损伤过程。
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标签：少突胶质前体细胞论文; 受体论文; 缺氧缺血论文; 脑白质论文;