猪圆环病毒1型Cap蛋白的原核表达及PCV-1/PCV-2抗体鉴别ELISA的建立

论文摘要

猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）是目前已知最小的动物病毒。根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列,将其分为PCV-1和PCV-2两型。PCV-1广泛存在于猪体内及猪源传代细胞系中,经动物感染试验证明PCV-1无致病性,但与猪的健康密切相关,因此对该病原的研究十分必要。PCV-2与猪群中发生的多种疾病相关,如断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征及先天性震颤等,给全世界养猪业带来了巨大的经济损失。本试验通过设计合成特异性引物,扩增PCV-1 ORF2基因并进行原核表达,用所获得的Cap重组蛋白经纯化后作为包被抗原建立了一种敏感、特异、稳定性好的间接ELISA方法。根据GenBank公布的PCV-1 ORF2基因序列,设计并合成三对特异性引物,以PCV-1为模板经PCR扩增出三个ORF2基因片段,将其克隆到pMD18-T载体中。经过测序,将三段ORF2基因定向克隆至原核表达载体pGEX-6P-1上,然后转入表达宿主菌BL21中,获得了目的蛋白,分子量分别约为41Ku、40Ku、38Ku。通过Western blot证明这三种重组蛋白均具有抗原性。选用抗原性最好的且不与PCV-2标准阳性血清发生交叉反应的CapB重组蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件建立了能检测血清中PCV-1抗体的间接ELISA。此外,用CapB蛋白和实验室已制备的PCV-2的Cap蛋白同时作为包被抗原,建立了一种能鉴别PCV-1和PCV-2的间接ELISA。用以上两种方法分别检测PRRSV、CSFV、PRV等病毒的标准阳性血清进行特异性试验,结果表明特异性良好;两种ELISA与免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）同时对92份血清样品进行检测,符合率分别为93.5%、96.7%;重复试验结果表明,变异系数都小于10%。应用以上两种方法对国内部分地区采集的227血清样品进行检测,结果有75份为PCV-1阳性,阳性率为33.04%。69份为PCV-2阳性,阳性率为30.4%,其中有7份为混合感染。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 病原学研究进展
• 1.1.1 病毒的发现
• 1.1.2 病毒的理化特性及培养特性
• 1.1.3 PCV的基因组特征
• 1.1.4 PCV基因组的复制与转录
• 1.1.5 病毒主要的编码蛋白
• 1.2 流行病学
• 1.3 PCV-2相关的疾病
• 1.3.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征
• 1.3.2 猪皮炎和肾病综合征
• 1.3.3 繁殖障碍
• 1.3.4 增生性坏死性肺炎
• 1.3.5 先天性震颤
• 1.3.6 猪呼吸道综合征
• 1.4 诊断方法
• 1.4.1 猪圆环病的临床诊断
• 1.4.2 猪圆环病的病理学诊断
• 1.4.3 猪圆环病毒的实验室诊断
• 1.5 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 质粒、载体、菌种、病毒、细胞
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 引物
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 PCV-1 ORF2基因的原核表达及纯化
• 2.2.2 检测PCV-1抗体的间接ELISA诊断方法的建立
• 2.2.3 PCV-1、PCV-2鉴别ELISA诊断方法的初步建立
• 3 结果与分析
• 3.1 PCV-1 ORF2基因的原核表达及纯化
• 3.1.1 PCV-1 ORF2A、ORF2B、ORF2C基因的扩增
• 3.1.2 重组克隆载体酶切鉴定
• 3.1.3 PCV-1 ORF2A、ORF2B、ORF2C基因核苷酸序列测定结果
• 3.1.4 重组表达载体酶切鉴定
• 3.1.5 重组蛋白表达及可溶性分析
• 3.1.6 重组蛋白的纯化及Western blot结果
• 3.2 检测PCV-1抗体的间接ELISA诊断方法的建立
• 3.2.1 CapA、CapB、CapC抗原性的比较
• 3.2.2 阳性血清效价的检测
• 3.2.3 抗原最适包被量与血清最适稀释度的确定
• 3.2.5 工作条件的优化
• 3.2.6 判定标准
• 3.2.7 特异性试验
• 3.2.8 敏感性试验
• 3.2.9 批内重复试验
• 3.2.10 与IPMA检测结果比较试验
• 3.2.11 临床样品检测
• 3.3 PCV-1、PCV-2鉴别ELISA诊断方法的初步建立
• 3.3.1 抗原最适包被量与血清最适稀释度的确定试验
• 3.3.2 工作条件的优化
• 3.3.3 特异性反应试验
• 3.3.4 批内重复试验
• 3.3.5 与IPMA检测结果比较试验
• 3.3.6 临床样品检测
• 4 讨论
• 4.1 重组蛋白原核表达
• 4.1.1 表达载体的选择
• 4.1.2 原核表达条件的优化
• 4.1.3 包涵体蛋白的纯化
• 4.2 目的蛋白的选择及应用
• 4.3 PCV-1 Cap间接ELISA方法的条件优化
• 4.4 PCV-1 Cap间接ELISA诊断方法的判定标准及应用
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文